肌苷生產(chǎn)菌的搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化及代謝通量分析.pdf

1、肌苷在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有著非常重要的用途：它是各種調(diào)味食品的營(yíng)養(yǎng)助鮮劑，可以治療冠心病、肝炎、白血球減少癥等疾病，同時(shí)也是抗生素生產(chǎn)的原料。但是，近年來(lái)隨著國(guó)外廠家對(duì)中國(guó)市場(chǎng)的沖擊，國(guó)內(nèi)的核苷發(fā)酵產(chǎn)業(yè)面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，為此提高發(fā)酵得率、降低生產(chǎn)成本，提高生產(chǎn)能力已經(jīng)成為當(dāng)務(wù)之急。
　　 本論文以實(shí)驗(yàn)室前期選育的枯草芽孢桿菌JMUKC2為研究對(duì)象，以肌苷產(chǎn)量為主要指標(biāo)，初步優(yōu)化了枯草芽孢桿菌JMUKC2生產(chǎn)肌苷的搖瓶發(fā)酵工藝；研究了

2、不同促進(jìn)劑對(duì)枯草芽孢桿菌JMUKC2積累肌苷的影響；并用代謝通量分析的方法解釋了不同促進(jìn)劑的添加對(duì)肌苷生產(chǎn)菌JMUKC2搖瓶發(fā)酵積累肌苷的作用機(jī)理。
　　 從枯草芽孢桿菌JMUKC2產(chǎn)肌苷的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基的基本成分及其發(fā)酵條件入手，利用單因素試驗(yàn)并結(jié)合正交試驗(yàn)對(duì)枯草芽孢桿菌JMUKC2的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并確定了其最佳搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方及最佳發(fā)酵條件。優(yōu)化后的最佳搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖140 g/L，酵母

3、膏17 g/L，玉米漿20 g/L，尿素7g/L，硫酸銨20 g/L，KH2PO47g/L，MgSO4·7H2O1 g/L，CaCO320 g/L。優(yōu)化后的生物量和肌苷產(chǎn)量均比優(yōu)化前有較大的提高：比初始培養(yǎng)基分別提高了41%和47%。優(yōu)化后的最佳搖瓶發(fā)酵條件為：接種時(shí)間為18 h，接種量為7%，裝液量為15 mL，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值為6.5，搖瓶發(fā)酵溫度為37℃?？莶菅挎邨U菌JMUKC2搖瓶發(fā)酵條件經(jīng)過(guò)優(yōu)化后，生物量和肌苷產(chǎn)量均比優(yōu)

4、化前有了較大的提高：比初始發(fā)酵條件分別提高了51%和222%。
　　 根據(jù)肌苷合成的不同調(diào)控機(jī)理，選擇并研究了五種對(duì)菌體生長(zhǎng)和肌苷積累均有促進(jìn)作用的促進(jìn)劑(檸檬酸鈉、葡萄糖酸鈣、氟化鈉、次黃嘌呤及氯化鈣)，且確定了其最適添加量，同時(shí)探討了肌苷合成與菌體內(nèi)蛋白質(zhì)含量、核酸含量之間的關(guān)系。當(dāng)復(fù)合添加這些不同組合的促進(jìn)劑時(shí)，所得肌苷產(chǎn)量比添加單一促進(jìn)劑時(shí)的肌苷產(chǎn)量會(huì)有顯著的提高，其中當(dāng)同時(shí)添加0.15%次黃嘌呤、2 mg/L氟化鈉、1

5、0 mg/L氯化鈣及15 g/L葡萄糖酸鈣時(shí)，肌苷產(chǎn)量達(dá)到了14.01 g/L，是對(duì)照組肌苷產(chǎn)量的4.39倍。
　　 基于物料的質(zhì)量守恒定律和代謝反應(yīng)中間代謝物的擬穩(wěn)態(tài)假設(shè)，結(jié)合發(fā)酵過(guò)程曲線，初步研究了不同促進(jìn)劑的添加對(duì)肌苷發(fā)酵過(guò)程不同時(shí)段(24 h-32 h，56 h-64 h，80-88 h)代謝流分布的影響。結(jié)果表明，添加不同的促進(jìn)劑可以引發(fā)枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)的代謝流遷移，增大肌苷合成途徑的代謝通量，而組合添加促進(jìn)劑對(duì)肌苷