l苯丙氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建代謝調(diào)控和發(fā)酵條件優(yōu)化

1、L-苯丙氨酸生產(chǎn)菌株的構(gòu)建、代謝調(diào)控和發(fā)酵條件優(yōu)化,王凱,,,,,1,實驗背景及意義,,2,實驗內(nèi)容,,3,主要框架結(jié)構(gòu),,4,實驗創(chuàng)新點與難點,實驗可行性分析,,一、研究背景及意義,基于L-Phe廣泛的應(yīng)用前景，近年來L-Phe成為氨基酸行業(yè)單品中產(chǎn)量增長最快的一種。發(fā)酵法生產(chǎn)L-Phe，國外報道最高產(chǎn)量為50 g/L，L-Phe在我國還未實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)，只有十多家公司利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-Phe。隨著L-Phe市場需求的增長，國內(nèi)

2、供需缺口必須及時得到緩解。,,1.1 應(yīng)用現(xiàn)狀及存在的問題,,,,國內(nèi)外研究人員在微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-Phe的研究中進(jìn)行了大量的工作并取得了一些重要研究成果，一些改良的菌株及技術(shù)已成功應(yīng)用于L-Phe的工業(yè)化生產(chǎn)中。然而，相比于其它種類的氨基酸，L-Phe的生產(chǎn)得率仍然較低，已有很多研究者嘗試了不同的方法，但目前仍停留在理論研究或?qū)嶒炇乙?guī)模的發(fā)酵階段。,1.重點在于篩選高產(chǎn)菌株，及如何防止菌株的退化而導(dǎo)致產(chǎn)能下降問題。 2.由于產(chǎn)

3、物抑制和副產(chǎn)物的過量合成等原因，以糖類為主要碳源的發(fā)酵法生產(chǎn)苯丙氨酸時的產(chǎn)物對底物的轉(zhuǎn)化效率仍然比較低。 3.用于工業(yè)生產(chǎn)的大腸桿菌經(jīng)常會感染噬菌體病毒。,,1.2 課題的提出,針對以上出現(xiàn)的問題有必要通過代謝工程手段構(gòu)建一個抗噬菌體污染并能高效生產(chǎn) L-Phe的重組大腸桿菌，并用發(fā)酵工程的方法提高菌體生產(chǎn) L-Phe 的能力，以此獲得高產(chǎn)穩(wěn)定的工程菌來滿足生產(chǎn)需求。,,BACK,二、實驗內(nèi)容,,,,,,實驗內(nèi)容,發(fā)酵生產(chǎn)L-Ph

4、e的重組質(zhì)粒的構(gòu)建,,,,,,抗噬菌體大腸桿菌的篩選,,,,1. L-苯丙氨酸的合成途徑和關(guān)鍵酶調(diào)控,,,,在研究中，我們從E. coli 抗β-2-噻吩丙氨酸的突變株中獲得一個新的pheAfbr基因，該基因?qū)⒂锌赡転镃M-PDT對L-Phe的反饋抑制敏感性機制的研究提供有用的信息，并有助于改進(jìn)菌株生產(chǎn)L-Phe的能力。分析其突變位點和方式，并在低拷貝、溫度誘導(dǎo)表達(dá)的質(zhì)粒中克隆、表達(dá)該基因和aroF基因以促進(jìn)L-Phe的過量合成。,2

5、. 抗噬菌體大腸桿菌的篩選,導(dǎo)致上述構(gòu)建的重組菌發(fā)酵生產(chǎn)L-Phe異常的主要原因是噬菌體污染。為克服噬菌體污染，我們進(jìn)行了抗噬菌體并能高產(chǎn)L-Phe的E. coli菌株的選育工作并對突變菌株在外源添加噬菌體條件下的搖瓶和發(fā)酵罐水平的發(fā)酵能力進(jìn)行了考察。,3.誘導(dǎo)溫度對重組菌發(fā)酵生產(chǎn)苯丙氨酸的影響,溫度作為發(fā)酵過程的重要因素之一，影響與生長代謝相關(guān)酶類的催化反應(yīng)速率及穩(wěn)定性，從而調(diào)節(jié)微生物的生長和代謝產(chǎn)物的合成。本章考察不同的誘導(dǎo)溫度對

6、重組菌生產(chǎn)L-Phe 的影響，并分析發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)的變化趨勢，在此基礎(chǔ)上提出并應(yīng)用了分階段誘導(dǎo)溫度的控制策略以提高 L-Phe 的生產(chǎn)效率。,三. 研究的主要框架結(jié)構(gòu),一 發(fā)酵法生產(chǎn) L-Phe 的重組質(zhì)粒的構(gòu)建NTG 誘變及抗β-2-噻吩丙氨酸突變菌株的篩選重組質(zhì)粒的構(gòu)建 轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定,,,,,重組質(zhì)粒的序列分析重組大腸桿菌的培養(yǎng)酶活性檢測質(zhì)粒穩(wěn)定性檢測L-Phe 產(chǎn)量的測定,,,,,二 噬菌體

7、的分離、純化及抗噬菌體大腸桿菌的篩選噬菌體 BP-1 的分離、純化NTG 誘變處理大腸桿菌以及篩選大腸桿菌感受態(tài)制備及質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化方法,,,,對上述構(gòu)建的重組菌進(jìn)行發(fā)酵參數(shù)檢測（菌體濃度、葡萄糖濃度和 L-Phe 產(chǎn)量測定）結(jié)果與討論,,三 誘導(dǎo)溫度對 重組抗噬菌體菌發(fā)酵生產(chǎn) L-Phe 的影響培養(yǎng)重組的抗噬菌體菌株在培養(yǎng)過程中改變培養(yǎng)溫度（設(shè)三個溫度梯度）分析不同的誘導(dǎo)溫度發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)的變化趨勢。（酶活、

8、L-Phe產(chǎn)量、菌體濃度、質(zhì)粒的穩(wěn)定性等）結(jié)果分析,,,,四. 研究創(chuàng)新點及難點,實驗難點,BACK,五.實驗可行性分析,1.通過大量查看有關(guān)于發(fā)酵法生產(chǎn)苯丙氨酸的資料，對其發(fā)酵代謝途徑有了比較深刻的認(rèn)識，對接下來研究提供理論基礎(chǔ)幫助。2.實驗用的大腸桿菌可通過自行培養(yǎng)獲得，培養(yǎng)方便，成本低。3.在細(xì)菌，尤其是E. coli 中，芳香族氨基酸生物合成途徑的關(guān)鍵酶、相應(yīng)的基因、代謝中間體以及調(diào)控方式等已研究得相當(dāng)清楚。4.實驗室具