海洋解脂耶羅威亞酵母菌產檸檬酸的研究.pdf

1、檸檬酸是一種重要的有機酸，在制藥業(yè)、食品業(yè)及化妝業(yè)等具有極多的用途，并對人體健康有一定的益處。工業(yè)檸檬酸主要是玉米、紅薯等糧食作物通過發(fā)酵方式獲得的。近年來世界糧食短缺，價格飛漲，使檸檬酸產品的低價優(yōu)勢不斷減小。木薯淀粉和菊粉是新型工業(yè)非糧食原料，其水解產物分別為葡萄糖和果糖，是生產檸檬酸的良好碳源，將這2種非糧食原料運用于檸檬酸的工業(yè)生產，在降低成本、節(jié)約糧食資源和糧食安全等方面具有良好的應用前景。
　　 目前，檸檬酸的工業(yè)生

2、產菌株主要是黑曲霉(Aspergillus niger)，但該菌發(fā)酵產酸易引起環(huán)境污染且其菌體結構不利于遺傳改造。產酸酵母菌解脂耶羅威亞酵母(Yarrowia lipolytica)能彌補黑曲霉產酸的不足，因而成為近年來研究的熱點。為了擴大產酸酵母菌種的篩選范圍，我們對實驗室現(xiàn)保存120株海洋解脂耶羅威亞酵母菌進行了篩選，獲得了1株高產檸檬酸的菌株Y.lipolyticaSWJ-1b(中國海洋微生物菌種保藏中心編號2E00068)。該菌

3、利用甘油(40.0 g/l)發(fā)酵產酸量為24.0±0.7g/l(檸檬酸生產力0.20g/lh)，高于陸地同種酵母菌相同條件下的發(fā)酵產酸量。通過進一步研究發(fā)現(xiàn)該菌發(fā)酵產酸的最佳碳源為葡萄糖，其用于產酸培養(yǎng)的最適濃度為40.0 g/l，發(fā)酵產酸量為25.5±1.2 g/l(0.21 g/lh)。
　　 木薯淀粉(Cassava strach)應用于檸檬酸生產的前提是產酸菌株必須具備水解木薯淀粉的能力，但Y.lipolytica SW

4、J-1b不能分泌淀粉酶，且外源淀粉酶(Amylase)基因在Y.lipolytica SWJ-1b中難以表達。本實驗室研究發(fā)現(xiàn)扣囊復膜酵母(Saccharomycopsis fibuligera)IFO0111可以產生大量的淀粉酶，可使用該菌產生的淀粉酶先將木薯淀粉水解，所得木薯淀粉水解液(碳源濃度40.0 g/l)進而被用于發(fā)酵產酸，其檸檬酸產量為29.4±0.3 g/l(0.25 g/lh)。而在2-1發(fā)酵罐中分批補料發(fā)酵培養(yǎng)時，檸

5、檬酸產量達60.2±1.8 g/l(0.21 g/l h)。
　　 最近幾年我們實驗室研究發(fā)現(xiàn)菊粉(Inulin)也是發(fā)酵工業(yè)很好的原料，Y。lipolytica SWJ-1b同樣不能產生菊粉酶，為了使產酸菌株能夠直接利用菊粉發(fā)酵產酸以簡化發(fā)酵生產工藝，我們將菊粉酶活力較高的馬克思克魯維酵母(Kluyveromyces marxianus)CBS6556的菊粉酶(Inulinase)基因成功整合至Y。lipolytica SWJ

6、-1b的基因組DNA，并通過表面展示技術將該基因表達的菊粉酶展示于Y.lipolytica SWJ-1b細胞表面，得到具穩(wěn)定菊粉酶活力的轉化菌株INU-87，其表面展示菊粉酶活力為22.6±0.8U/mg細胞干重，具有較高的外切酶活性。研究發(fā)現(xiàn)該表面展示菊粉酶與菌株K.marxianus的原始菊粉酶性質基本一致，且表面展示技術的應用使該酶易于回收利用。轉化菌株INU-87在菊粉培養(yǎng)基(菊粉濃度40.0g/l)中一步發(fā)酵產酸時，檸檬酸產量

7、為31.2±1.6g/l(0.26g/lh)，其在2-1發(fā)酵罐中發(fā)酵菊粉(100.0g/l)產酸量可達68.9±2.4 g/l(0.22g/lh)。轉化菌株INU-87以非糧原料菊粉一步發(fā)酵產檸檬酸，節(jié)約了糧食資源，降低了檸檬酸的生產成本，簡化了非糧原料發(fā)酵產酸工藝，對檸檬酸的工業(yè)生產具有深遠意義。
　　 產酸酵母菌最大的缺點在于發(fā)酵產酸過程中副產物異檸檬酸(Iso-citrateacid，ICA)產量和菌體油脂(Lipid)累

8、積量較高，對檸檬酸產量的提高極為不利。產酸代謝途徑中的異檸檬酸裂解酶(Iso-citrate lyase ICL)能夠減少異檸檬酸的產量，而ATP-檸檬酸裂解酶(ATP-citrate lyase ACL)則促進油脂累積。為了減少發(fā)酵產檸檬酸過程中的副產物產量，本實驗通過轉化菌株INU-87 ACL1基因敲除和ICL1基因超表達，得到遺傳改良菌株IAI-30。該菌株的ACL1基因表達量降低了18.9％，受該基因控制的ACL酶活力明顯降低

9、；同時，其ICL1，基因表達量增加了259.4％，ICL酶活力有較大提高。經測定遺傳改良菌株IAI-30的油脂累積量和副產物異檸檬酸的產量都明顯降低，其在菊粉產酸培養(yǎng)基(菊粉濃度40.0g/l)中發(fā)酵產酸量增至36.0±0.6g/l(0.30g/lh)。而遺傳改良菌株IAI-30在2-1發(fā)酵罐中一步發(fā)酵菊粉(100.0g/l)產酸量可達84.0±1.6g/l(0.39g/l h)。遺傳改良從基因水平上對產酸菌株的產酸代謝途徑做出了一定調