高蛋白海洋解脂耶羅維亞酵母遺傳改良以及表達(dá)重組抗菌肽的研究.pdf

1、從分離自海水、海泥、海魚腸道與海藻的78株海洋酵母中篩選出7株高蛋白海洋酵母(hcx-2,L2-2,W1-6,Qme,SWJ-1b,W2B和Z1721-2),經(jīng)測定它們的粗蛋白含量都超過了40.0％(w/w)。其中菌株SWJ-1b蛋白含量最高,達(dá)到47.6％(w/w),其細(xì)胞量(g/L)為6.7,其可作為潛在的單細(xì)胞蛋白使用。菌株SWJ-1b分離自魚腸道。根據(jù)傳統(tǒng)的鑒定方法、Biolog微生物自動分析系統(tǒng)鑒定及分子生物學(xué)鑒定,菌株SWJ

2、-1b最終被鑒定為解脂耶羅維亞酵母菌(Yarrowialipolytica)。
　　 利用表面展示系統(tǒng)對得到的高蛋白海洋Y.lipolytica菌株SWJ-1b進(jìn)行了遺傳改造。編碼增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的基因被插入表面展示質(zhì)粒pINA1317-Y1CWP110中,并在Y.lipolytica菌株SWJ-1b的尿嘧啶缺陷型中表達(dá),EGFP被成功展示在酵母細(xì)胞表面,且發(fā)現(xiàn)100％的轉(zhuǎn)化菌株細(xì)胞表面都展示有此錨定的目標(biāo)蛋白。對

3、海洋酵母Y.lipolytica SWJ-1b菌株,其尿嘧啶缺陷型菌株22a-2和篩選出的展示有EGFP的陽性轉(zhuǎn)化子106進(jìn)行了粗蛋白含量、細(xì)胞量、氨基酸含量、脂肪酸含量等營養(yǎng)組分分析,發(fā)現(xiàn)三者粗蛋白含量(w/w)分別為:54.9±1.3％、54.9±1.6％、51.1±0.8％,細(xì)胞量(g/L)分別為:12.0±0.1、12.0±0.2、16.0±0.1。三者氨基酸組分仍基本一致,特別是必需氨基酸,如賴氨酸、甲硫氨酸和亮氨酸等。篩選的

4、轉(zhuǎn)化子106的C18:1和C18:3脂肪酸含量高于野生型SWJ-1b菌株,C16:0和C16:1脂肪酸含量低于SWJ-1b。表明海洋酵母SWJ-1b可經(jīng)過基因改良錨定外源蛋白而且仍可進(jìn)一步作為單細(xì)胞蛋白使用。
　　 將編碼來自櫛孔扇貝(Chlamys farreri)組蛋白H2A N-端抗菌肽的DNA片段連接到表達(dá)質(zhì)粒pINA1317中,在Y.lipolytica SWJ-1b菌株中表達(dá)。在PBB培養(yǎng)基中培養(yǎng)120h后,轉(zhuǎn)化子Y

5、1-H2A-29a產(chǎn)生了較多的抗菌肽,獲得的上清對哈維氏弧菌、鰻弧菌和副溶血弧菌都具有抗菌活性。對三者最小抑菌濃度(μg ofprotein/mL)分別是4.47±0.4、8.95±1.4和1.12±0.2。對三者的抑菌圈直徑分別為:14.0 mm、11.0mm和24.0 mm。然而我們發(fā)現(xiàn)上清對革蘭氏陽性菌大腸桿菌、枯草桿菌和金黃色葡萄球菌均無抑菌活性。用Ni2+親和層析純化帶有6×His標(biāo)簽的重組抗菌肽,純化的重組抗菌肽分子量為4.

6、5 kDa。透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),利用抗菌肽處理副溶血弧菌完整細(xì)胞和原生質(zhì)體細(xì)胞后,抗菌肽造成了完整細(xì)胞和原生質(zhì)體細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)溶物泄露,并導(dǎo)致細(xì)胞死亡。這表明抗菌肽能夠通過細(xì)胞外基質(zhì)或細(xì)菌脂多糖、外膜和肽聚糖等不同屏障,在細(xì)胞膜上形成孔洞。SWISS模型分析表明抗菌肽中具有α螺旋結(jié)構(gòu),抗菌肽氨基酸的疏水性分布表明抗菌肽具有很多疏水性氨基酸,這可能和抗菌肽的抑菌活性機制相關(guān)。將已證實成功表達(dá)了抗菌肽基因的酵母轉(zhuǎn)化子Y1-H2A-29a培

7、養(yǎng)在YPD培養(yǎng)基,PPB培養(yǎng)基和含有硫酸銨的豆餅粉水解液中,經(jīng)測定細(xì)胞蛋白含量(w/w)分別為48.9±0.3％、45.3±0.8％和46.1±1.4％,細(xì)胞干重(g/L)分別為12.0±0.9、11.5±0.7和9.9±0.6。能產(chǎn)生抗菌肽的Y.lipolytica SWJ-1b菌株仍能作為單細(xì)胞蛋白使用。這是關(guān)于利用高蛋白海洋解脂耶羅維亞酵母產(chǎn)生重組抗菌肽的首次報道。
　　 將編碼來自櫛孔扇貝(Chlamys farreri

8、)組蛋白H2A N-端的抗菌肽和編碼菊粉酶基因INU1的DNA片段分別連接到表達(dá)質(zhì)粒pINA1317中,并在Y.lipolyticaSWJ-1b中共表達(dá)。獲得的重組產(chǎn)物對哈維氏弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌具備抑菌活性,對哈維氏弧菌、鰻弧菌、副溶血弧菌作用產(chǎn)生的抑菌圈直徑分別為:12.0mm、8.0 mm和15.0mm,最小抑菌濃度(μg of protein/mL)為:6.28±0.2、13.63±0.4和2.51±0.7。對大腸桿菌、枯草