植酸酶phyA基因在解脂耶氏酵母中的表達研究.pdf

1、植酸酶近年來成為一種新型的綠色飼料添加劑，由于它能把植酸降解為肌醇和無機磷，可以提高飼料的利用率，降低成本，并減少對環(huán)境的污染，因而廣泛應用于飼料、食品、醫(yī)藥工業(yè)以及環(huán)境保護。但由于天然植酸酶的熱穩(wěn)定性限制了植酸酶在生產用的應用。解脂耶氏酵母可作為一種優(yōu)良的表達宿主，它被認為是安全的，能用于食品和藥物生產中，并能利用很多普通的碳水化合物和脂肪作為碳源，使其更適合不同的工業(yè)應用。本研究通過選用解脂耶氏酵母的表達載體PT14(改造的pINA

2、1296載體)和pINA1297，構建出重組PT14-phyA和pINA1297-phyA解脂耶氏酵母菌株，期望能夠得到大量活性高及熱穩(wěn)定性好的重組酶。目前，國內外還沒有用PT14和pINA1297表達植酸酶phyA的報道。研究方法和內容如下：
　　 1.植酸酶phyA基因的克?。豪寐然c法提取畢赤酵母GS115-phyA總基因組DNA，以其總DNA為模板，根據黑曲霉NRRL3135植酸酶phyA基因序列設計出兩對引物，通過P

3、CR方法擴增出不含有信號肽和內含子的PT14phyA和1297phyA兩種植酸酶phyA片段，其中PT14phyA含有LacO編碼基因中的7個堿基，1297phyA片段中含有sfiⅠ和KpnⅠ兩個限制性酶切位點。
　　 2.將擴增出的PT1phyA片段與解脂耶氏酵母po1g的表達載體表達載體PT14進行連接，構建出重組表達載體PT14-phyA，PT14-phyA經NotⅠ線性化用電擊轉化方法轉化到解脂耶氏酵母po1g中，利用M

4、D和含有植酸鈣的PPB平板初篩出重組解脂耶氏酵母po1g。將篩選出的重組解脂耶氏酵母po1g接入到PPB液體培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)，表達的植酸酶酶活第四天時達到最大為22.75U/mL，表達的植酸酶最適pH值較高，經過90℃處理10 min后還有62.47％的殘留活性，并且其抵抗胃蛋白酶和胰蛋白酶能力也較強。
　　 3.將擴增出的1297phyA片段與解脂耶氏酵母po1h的表達載體表達載體pINA1297進行連接，構建出重組表達載

5、體pINA1297-phyA，pINA1297-phyA經NotⅠ線性化后用醋酸鋰轉化方法轉化到解脂耶氏酵母po1h中，利用YNBcasa和含有植酸鈣的PPB平板初篩出重組解脂耶氏酵母po1h。將篩選出的重組解脂耶氏酵母po1h接入到YM液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，表達的植酸酶酶活第六天時達到最大為636.23 U/mL。表達上清經SDS-PAGE分析得到表達植酸酶分子量約為130 kD，但通過去糖基化處理后其分子量變?yōu)?1 kD，與理論值相