體外循環(huán)對(duì)腦血管功能影響及相關(guān)腦保護(hù)策略的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、隨著心臟外科手術(shù)和體外循環(huán)技術(shù)的不斷進(jìn)步，體外循環(huán)造成術(shù)后多臟器功能損害日益受到重視。早期和晚期的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生率仍然很高。腦血流中斷或局部血流分配不充分是腦損傷的重要機(jī)制，而腦血流灌注完全取決于腦血管的功能狀態(tài)。目前國內(nèi)外對(duì)于體外循環(huán)引起腦血管功能變化的研究很少，尤其是國內(nèi)對(duì)于腦血管功能變化的文獻(xiàn)基本是空白。因此迫切需要深入的實(shí)驗(yàn)研究來揭示體外循環(huán)對(duì)腦血管功能變化及其發(fā)生機(jī)制，并在此基礎(chǔ)上提出相關(guān)的腦保護(hù)策略。
　　 第一

2、部分 S.D.大鼠閉胸體外循環(huán)模型的研究
　　 目的：建立S.D.大鼠體外循環(huán)(CPB)模型，為體外循環(huán)腦、肺、肝、腎等重要臟器損傷的基礎(chǔ)研究提供經(jīng)濟(jì)實(shí)用的動(dòng)物模型。
　　 方法：30只S.D.大鼠平均體重(467.9±44.5)g，隨機(jī)平均分為5組，每組6只。A組：體外循環(huán)60分鐘組、B組：體外循環(huán)120分鐘組、C組：深低溫低流量60分鐘組、D組：深低溫停循環(huán)60分鐘組和E組：空白對(duì)照組。體外循環(huán)采用右頸內(nèi)動(dòng)脈插管灌注

3、、右頸外靜脈插管至右房引流方法建立閉胸體外循環(huán)轉(zhuǎn)流，低溫誘發(fā)室顫心臟停跳。術(shù)中進(jìn)行體溫、有創(chuàng)血壓、心電圖監(jiān)測(cè)，并在在麻醉成功后(T1)、CPB開始前(T2)、CPB30min(T3)、CPB60min(T4)、CPB90min(T5)、CPB120min(T6)和體外循環(huán)結(jié)束后(T7)七個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄生命體征和進(jìn)行股動(dòng)脈血?dú)夥治?。血?dú)夤芾聿捎忙练€(wěn)態(tài)策略。
　　 結(jié)果：24只大鼠均順利建立體外循環(huán)模型，生命體征和血?dú)庵笜?biāo)均在合理范圍

4、內(nèi)，脫離體外循環(huán)時(shí)平均血壓維持60mmHg以上，脫離體外循環(huán)后心功能均順利恢復(fù)。
　　 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)建立大鼠閉胸不同體外循環(huán)模型是切實(shí)可行的，該模型是研究體外循環(huán)生理的一個(gè)可信賴的平臺(tái)，有利于研究體外循環(huán)后多臟器損傷的病理生理變化。
　　 第二部分體外循環(huán)對(duì)大鼠腦血管功能的影響及其機(jī)制研究
　　 目的：研究體外循環(huán)轉(zhuǎn)流期間腦血管舒縮變化和不同體外循環(huán)時(shí)間和體外循環(huán)模式對(duì)腦血管反應(yīng)性的影響，并探討腦血管功能的改變的

5、機(jī)制。通過蛋白水平和細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定體外循環(huán)對(duì)腦細(xì)胞損傷程度及腦代謝改變，明確腦損傷的程度與腦血管功能變化之間的相關(guān)性。
　　 方法：
　　 一、大鼠腦血管在不同體外循環(huán)模式下功能的變化：
　　 實(shí)驗(yàn)分組同實(shí)驗(yàn)第一部分。在CPB開始前(T2)、CPB30min(T3)、CPB60min(T4)、CPB90min(T5)、CPB120min(T6)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)觀察內(nèi)皮素-1(ET-1)和一氧化氮(NO)血漿濃度變

6、化，并通過計(jì)算ET-1/NO比值研究體外循環(huán)中腦血管舒縮變化規(guī)律。取右大腦中動(dòng)脈(MCA)，進(jìn)行血管反應(yīng)性測(cè)定，包括乙酰膽堿(Ach)濃度相關(guān)的血管內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管舒張反應(yīng)、血管平滑肌對(duì)不同壓力的肌源性反應(yīng)、硝普鈉(SNP)和血管緊張素誘發(fā)的血管平滑肌舒縮反應(yīng)。取海馬區(qū)腦組織進(jìn)行微血管的內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察。
　　 二、體外循環(huán)對(duì)大鼠腦血管功能失調(diào)的機(jī)制研究：
　　 在CPB開始前(T2)、CPB30min(T3)、C

7、PB60min(T4)、CPB90min(T5)、CPB120min(T6)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的動(dòng)態(tài)血漿濃度變化，并分析其與腦血管舒縮變化規(guī)律的關(guān)系。采用免疫組織化學(xué)ICAM-1染色半定量觀察腦血管壁的炎性反應(yīng)強(qiáng)度。采用Western Blotting技術(shù)進(jìn)行海馬內(nèi)皮型一氧化氮合酶蛋白的定量測(cè)定，并分析其與頸內(nèi)靜脈NO含量的關(guān)系。
　　 三、大鼠體外循環(huán)腦血管功能變化與腦損傷的關(guān)

8、系研究：
　　 在CPB30min(T3)、CPB60min(T4)、CPB90min(T5)、CPB120min(T6)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定血漿S100β蛋白含量，并評(píng)價(jià)其變化與腦血管舒縮狀態(tài)指標(biāo)ET-1/NO比值相關(guān)性。磷脂結(jié)合蛋白Ⅴ法測(cè)定海馬細(xì)胞凋亡比例，并評(píng)價(jià)腦細(xì)胞凋亡比例與腦血管舒縮狀態(tài)相關(guān)性；腦組織病理切片H.E.染色評(píng)價(jià)神經(jīng)元損傷情況。采用電泳法測(cè)定額頂葉皮質(zhì)腦組織ATP含量，并評(píng)價(jià)腦組織ATP含量與腦血管舒縮狀態(tài)相關(guān)性

9、。在CPB開始前(T2)、CPB30min(T3)、CPB60min(T4)、CPB90min(T5)、CPB120min(T6)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定乳酸含量和頸內(nèi)靜脈氧飽和度，并評(píng)價(jià)頸內(nèi)靜脈乳酸含量和氧飽和度與腦血管舒縮狀態(tài)相關(guān)性。
　　 結(jié)果：
　　 一、大鼠腦血管在不同體外循環(huán)模式下功能的變化：
　　 4組S.D.大鼠均成功建立和脫離體外循環(huán)。體外循環(huán)60分鐘后ET-1隨轉(zhuǎn)流時(shí)間延長(zhǎng)而升高，在DHLF和DHCA組

10、復(fù)溫再灌注時(shí)ET-1含量也明顯升高。NO含量在轉(zhuǎn)流30分鐘達(dá)到峰值，此后逐漸下降。ET-1/NO比值在轉(zhuǎn)流30分鐘低于術(shù)前水平，而此后逐漸升高，各組均在轉(zhuǎn)流末達(dá)峰值。
　　 在不同壓力負(fù)荷下，MCA肌源性活動(dòng)功能檢測(cè)各組間無明顯差異。血管緊張素誘導(dǎo)的血管平滑肌收縮功能和硝普鈉誘導(dǎo)的血管平滑肌舒張功能均正常。而在不同乙酰膽堿濃度下，A組MCA內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管舒張功能即明顯受損。B組與A組相比在各個(gè)Ach濃度血管舒張率無差異，而C

11、組和D組在Ach濃度依賴的血管舒張率均明顯較B組差，而C、D二組間比較無明顯差異。
　　 海馬微血管和內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)A、B二組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)與正常組相仿，未見異常改變。而C組毛細(xì)血管形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，V-R間隙增寬，D組毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷明顯，V-R間隙嚴(yán)重增寬伴周圍組織腦水腫。
　　 二、體外循環(huán)對(duì)大鼠腦血管功能失調(diào)的機(jī)制研究
　　 TNF-α和IL-6的濃度在體外循環(huán)各組隨轉(zhuǎn)流時(shí)間延長(zhǎng)而顯著升高。T

12、NF-α與ET-1/NO比值間相關(guān)系數(shù)為r=0.637(P<0.001)。IL-6與ET-1/NO比值間相關(guān)系數(shù)為r=0.521(P<0.001)。海馬病理切片ICAM免疫組織化學(xué)染色提示在體外循環(huán)各組均呈陽性。各組間比較按A、B、C、D組順序炎癥反應(yīng)強(qiáng)度依次遞增，且該強(qiáng)度與ET-1/NO比值間相關(guān)系數(shù)為r=0.872(P<0.001)。
　　 Western Blotting法檢測(cè)eNOS蛋白含量發(fā)現(xiàn)各體外循環(huán)組含量均明顯低于

13、空白對(duì)照。B組eNOS蛋白含量亦低于A組(P=0.002)。D組亦顯著低于C組(P=0.002)。eNOS蛋白含量與頸內(nèi)靜脈NO含量相關(guān)系數(shù)r=0.866(P<0.001)。
　　 三、大鼠體外循環(huán)腦血管功能變化與腦損傷的關(guān)系研究
　　 S100β蛋白水平在各體外循環(huán)組隨轉(zhuǎn)流時(shí)間延長(zhǎng)而不斷升高。而各組間比較，S100β蛋白水平在T5、T6高低依次為D組、C組和B組。S100β蛋白含量與ET-1/NO比值之間相關(guān)系數(shù)為0.

14、753(P<0.001)。
　　 體外循環(huán)可引起海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡明顯增加，AnnexinⅤ法測(cè)定凋亡比例大小依次為D組、C組、B組和A組。細(xì)胞凋亡比例與ET-1/NO比值之間相關(guān)系數(shù)為0.793(P<0.001)。病理學(xué)檢測(cè)在各組切片均未觀察到明顯的神經(jīng)元受損的表現(xiàn)，僅可見血管周圍炎癥，各組病理學(xué)評(píng)分均為0分。
　　 常溫轉(zhuǎn)流組ATP含量與E組間無明顯差異，而C組和D組明顯下降，其中D組ATP含量最低，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)

15、意義(P=0.002)。腦組織ATP含量與T6時(shí)間點(diǎn)ET-1/NO比值之間相關(guān)系數(shù)為-0.808(P<0.001)。乳酸含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)C組和D組在T4、T5、T6明顯高于其他各組，與ET-1/NO比值相關(guān)性較弱。
　　 結(jié)論：
　　 一、大鼠腦血管在不同體外循環(huán)模式下功能的變化：
　　 1.腦血管在體外循環(huán)期間的縮血管效應(yīng)明顯大于舒血管效應(yīng)，整體腦組織處于低灌注狀態(tài)。
　　 2.大腦中動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞依賴的血管

16、舒張功能受損，在體外循環(huán)60分鐘即可出現(xiàn)，并且在DHLF和DHCA組損傷明顯加重，表明腦血管舒縮緊張度的不穩(wěn)定性；而體外循環(huán)對(duì)平滑肌細(xì)胞功能無明顯影響。
　　 3.通過大腦微血管和內(nèi)皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)觀察，發(fā)現(xiàn)在DHCA組內(nèi)皮細(xì)胞損傷表現(xiàn)及周圍腦組織水腫。
　　 二、體外循環(huán)對(duì)大鼠腦血管功能失調(diào)的機(jī)制研究
　　 1.體外循環(huán)可引起TNF-α和IL-6為代表的炎性因子顯著升高，炎性因子水平與腦血管舒縮狀態(tài)存在明顯相關(guān)

17、性，說明腦血管舒縮功能受損可能或部分為全身炎癥反應(yīng)引起。
　　 2.體外循環(huán)可引起腦組織eNOS蛋白表達(dá)水平明顯降低，且在DHLF和DHCA組降低尤為明顯，提示炎癥反應(yīng)和缺血-再灌注損傷是影響eNOS蛋白水平的重要因素。
　　 3.腦組織eNOS蛋白水平與頸內(nèi)靜脈血NO含量呈明顯相關(guān)，提示腦血管eNOS功能狀態(tài)是腦血管舒縮狀態(tài)的重要因素。
　　 三、大鼠體外循環(huán)腦血管功能變化與腦損傷的關(guān)系研究
　　 1.

18、體外循環(huán)，特別是DHLF和DHCA轉(zhuǎn)流可引起血漿S100β蛋白為標(biāo)志的神經(jīng)細(xì)胞明顯損傷，其損傷程度與腦血管灌注水平一致。
　　 2.體外循環(huán)可引起神經(jīng)細(xì)胞凋亡比例升高，說明凋亡是神經(jīng)系統(tǒng)損傷的重要原因之一。細(xì)胞凋亡比例與腦血管舒縮狀態(tài)之間存在相關(guān)性。
　　 3.體外循環(huán)后早期2小時(shí)之內(nèi)，未能在H.E.染色的病理切片上發(fā)現(xiàn)明顯的神經(jīng)細(xì)胞受損證據(jù)。
　　 4.DHLF和DHCA可引起細(xì)胞ATP含量明顯下降和頸內(nèi)靜脈乳

19、酸水平明顯升高，其程度與腦血管舒縮狀態(tài)一致。
　　 第三部分應(yīng)用一氧化氮供體對(duì)大鼠體外循環(huán)腦損傷的保護(hù)策略研究
　　 目的：觀察通過給予NO供體以提高血漿NO濃度，能否通過減輕體外循環(huán)引起的炎癥反應(yīng)強(qiáng)度，提高腦組織灌注狀態(tài)，從而減輕大鼠體外循環(huán)后急性腦損傷。
　　 方法：36只大鼠隨機(jī)平均分為6組，每組6只。B組：常溫體外循環(huán)120min組、C組：深低溫低流量60min組、D組：深低溫停循環(huán)60min組、F組：常

20、溫體外循環(huán)120min+保護(hù)組、G組：深低溫低流量60min+保護(hù)組和H組：深低溫停循環(huán)60min+保護(hù)組。保護(hù)方法為靜脈輸注硝普鈉3mg/kg/h至CPB結(jié)束，加用去氧腎上腺素維持平均動(dòng)脈血壓在60mmHg以上。
　　 各組CPB30min((T3)、CPB60min(T4)、CPB90min(T5)、CPB120min(T6)4個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定血漿S100β蛋白、AnnexinⅤ法測(cè)定海馬細(xì)胞凋亡比例、右額頂葉皮質(zhì)腦組織ATP含

21、量測(cè)定、在CPB開始前(T2)、CPB30min(T3)、CPB60min(T4)、CPB90min(T5)、CPB120min(T6)5個(gè)時(shí)間點(diǎn)測(cè)定頸內(nèi)靜脈乳酸含量和氧飽和度等腦代謝指標(biāo)及大腦海馬區(qū)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察分別進(jìn)行保護(hù)組與非保護(hù)組比較，觀察NO供體的保護(hù)效應(yīng)。
　　 在CPB體外循環(huán)開始(T2)和體外循環(huán)120分鐘(T6)二個(gè)時(shí)間點(diǎn)抽取頸內(nèi)靜脈血，組間進(jìn)行TNF-α和IL-6濃度比較，確定NO供體是否通過降

22、低炎性因子水平起到神經(jīng)保護(hù)作用。定量測(cè)定各組海馬eNOS蛋白并進(jìn)行組間比較，了解給予NO供體后對(duì)eNOS蛋白含量的影響。
　　 結(jié)果：各組36只S.D.大鼠均順利建立體外循環(huán)。B組和F組、C組和G組、D組和H組比較，在T5、T6時(shí)間點(diǎn)各保護(hù)組頸內(nèi)靜脈血S100β蛋白含量均低于對(duì)照組；各保護(hù)組凋亡比例均明顯低于對(duì)照組；各保護(hù)組額頂葉皮質(zhì)腦組織ATP含量均高于對(duì)照組；在DHLF和DHCA保護(hù)組轉(zhuǎn)流末乳酸含量明顯低于對(duì)照組。T6時(shí)間點(diǎn)