基于膠原-Matrigel支架材料的工程化心肌組織構建及體內移植的實驗研究.pdf

1、缺血性心臟疾病是威脅人類健康的頭號殺手之一。心肌梗死伴隨著功能性心肌細胞大量死亡，最終導致心力衰竭。針對心衰晚期患者，心臟移植手術是目前臨床治療的唯一選擇。但因存在供體器官短缺、免疫排斥反應及一系列移植后并發(fā)癥等問題，而無法在臨床廣泛應用，急需尋找新的有效治療方法和手段。組織工程這門交叉學科的興起，為根治心臟疾病帶來了希望。
　　 近年來，心肌組織工程研究進展迅速。國內外相繼以新生大鼠心肌細胞、間充質細胞、胚胎干細胞(ESC)源

2、心肌細胞為種子細胞，在體外成功再造了工程化心肌組織，再造心肌組織具有節(jié)律性收縮特性，并在組織結構方面與正常新生在體心肌組織相類似。盡管如此，目前心肌組織工程仍面臨種子細胞來源選擇、如何優(yōu)化心肌細胞-支架材料體外培育環(huán)境，以及如何提高再造心肌組織的質量等一系列關鍵問題。
　　 從國內外研究現(xiàn)狀分析，Zimmermann等利用膠原/Matrigel為支架體外構建心肌這一實驗體系最為成功。但是該體系作為心肌體外再造模型采用的是動態(tài)力學

3、拉伸，作為體外心肌再造研究模型的穩(wěn)定性和可靠性尚有待提高。此外，隨著相關研究的不斷深入，研究人員對如何實現(xiàn)工程化組織體外血管化、以及針對再造心肌組織中非心肌細胞成分對再造心肌組織質量和心肌細胞體外三維重構的影響給予了越來越多的關注。與此同時，本室以往利用該實驗體系，以ESC源心肌細胞為種子細胞，雖然成功在體外制備了心肌組織，但因獲得種子細胞實驗流程復雜、費時長而影響了再造心肌效率與質量。
　　 針對以上分析，本研究利用膠原/Ma

4、trigel實驗體系，開展了基于靜態(tài)力學拉伸模型下的心肌組織體外再造研究，并通過添加血管內皮細胞的方式，研究了血管內皮細胞提高再造心肌組織的質量的能力;與此同時，利用膠原/Matrigel實驗體系，進行了ESC分化發(fā)育的研究，重點觀察了ESC自發(fā)分化發(fā)育及向心肌細胞定向誘導分化情況，在此基礎上，利用已探索的定向誘導分化條件，研究ESC在本實驗體系下進一步分化形成心肌組織的能力，并對其動物心梗修復能力進行研究。
　　 本論文的主要

5、研究內容與結果簡要概括如下，共分為以下四個部分：
　　 第一部分：基于靜態(tài)力學拉伸模型下的心肌組織體外再造研究
　　 再造心肌組織的質量與微環(huán)境和非心肌細胞的作用關系密切。其中力學微環(huán)境對于再造心肌組織的質量至關重要。目前國內外常見的體外力學拉伸條件以動態(tài)力學拉伸為主，該力學拉伸條件存在一定的局限性。相比之下，再造心肌作為心肌體外發(fā)育研究模型，靜態(tài)力學拉伸具有明顯的優(yōu)勢，其穩(wěn)定性和可靠性均較高。此外，近年來發(fā)育生物學研究

6、表明，心肌中非心肌細胞成分對心肌細胞三維重構與心臟功能的發(fā)揮均起著重要作用，尤其是針對Telocytes細胞在心臟發(fā)育中作用的研究，是目前研究的熱點之一。
　　 在本部分研究中，首先建立了基于膠原/Matrigel三維立體靜態(tài)力學拉伸體系；其次，利用該體系，以新生大鼠心肌細胞為種子細胞，成功在體外構建了工程化心肌組織片層。在此基礎上，通過組織學染色及免疫組織化學染色，對體外再造心肌組織中是否存在Telocytes細胞進行檢測，并

7、對其在心肌細胞三維重構與心臟功能發(fā)揮中的作用進行探討。研究結果分別簡要介紹如下。
　　 在基于膠原/Matrigel三維立體靜態(tài)力學拉伸體系建立方面：研究結果表明，靜態(tài)力學拉伸抵抗了膠原凝膠在細胞存在時的強烈收縮，避免了由于過度收縮而引起的組織變厚，防止了材料中央部位細胞的大量死亡。在實施靜態(tài)力學拉伸后，再造心肌組織在體外始終維持一定的形狀和厚度，形成較均一的組織片層。
　　 在工程化心肌組織片層制備方面：研究結果表明，

8、心肌細胞在膠原/Matrigel三維立體靜態(tài)力學拉伸體系中，排列形成致密的肌纖維束，沿著靜態(tài)拉伸力的方向充分伸展。激光共聚焦觀察發(fā)現(xiàn)，可見心肌細胞相互連接部位部分區(qū)域存在Connexin43陽性染色，說明心肌細胞之間形成功能合胞體。此外，透射電鏡結果表明工程化心肌組織中，心肌細胞肌小節(jié)排列具有方向性，并且可以觀察到與細胞機械收縮和電信號傳導密切相關的超微結構，如縫隙連接、橋粒等。
　　 在工程化心肌組織中是否存在Telocyte

9、s細胞方面：組織學染色可以觀察到再造心肌組織中存在一種長梭形細胞，具有兩個或三個長細胞突起，形態(tài)上與Telocytes細胞相似。此外，免疫組織化學染色結果表明，這類長梭形細胞表達SMA陽性、Vimentin陽性和CD117陽性。根據(jù)以上實驗結果，我們初步判定在工程化心肌組織中可能存在Telocytes細胞。
　　 第二部分：組織工程化心肌體外血管化研究
　　 再造組織血管化研究一直是組織工程包括心肌組織工程研究關注的焦點

10、。近年來國內外研究報道表明，血管內皮細胞在三維支架材料中可形成血管樣結構，并且血管內皮細胞還對心肌細胞體外空間重構、存活和提高再造心肌組織的質量發(fā)揮重要作用。本部分研究，在前期建立基于膠原/Matrigel支架材料構建工程化心肌組織的基礎上，進一步在凝膠體系中將血管內皮細胞與心肌細胞復合，深入研究了血管內皮細胞對心肌組織血管化能力和提高心肌組織質量的促進作用。
　　 研究結果表明，復合了血管內皮細胞的組織工程化心肌中，血管樣結構

11、形成明顯增加，可見較多vWAg陽性的血管內皮細胞排列形成條索樣結構。此外，血管內皮細胞還對心肌細胞空間排布上產(chǎn)生影響，cTnT和vWAg熒光雙標記激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)，心肌細胞與血管內皮細胞在空間上相互靠近，心肌細胞更偏向于在血管內皮細胞網(wǎng)中存在。此外，加入血管內皮細胞還可以穩(wěn)定再造心肌組織結構，提高再造心肌組織的收縮能力。
　　 第三部分：ESC在膠原/Matrigel支架材料中分化發(fā)育的實驗研究
　　 在ESC分化發(fā)育

12、研究中，擬胚體(EBs)的形成對于ESC分化發(fā)育發(fā)揮著重要作用?，F(xiàn)有ESC分化發(fā)育研究體系多是將ESC形成EBs與EBs進一步分化發(fā)育這一連續(xù)過程分割為兩個階段：首先是在二維或三維環(huán)境中形成EBs，隨后將所形成的EBs二維貼壁誘導分化或接種在三維支架材料中進一步誘導分化。
　　 在本研究中，基于膠原/Matrigel這一實驗體系在心肌再造方面取得的良好結果和建立的平臺條件，將ESC以單細胞形式直接接種在膠原/Matrigel支架

13、材料中，進而觀察EBs形成以及后續(xù)分化發(fā)育情況，從而探討膠原/Matrigel對ESC在三維立體環(huán)境中直接形成EBs的可行性。重點針對ESC接種密度對EBs形成的影響、不同支架材料組成對EBs形成與分化的影響以及ESC在本體系下自發(fā)分化情況進行了研究。
　　 其中，在ESC接種密度對EBs形成影響的研究方面，結果表明ESC在膠原/Matrigel支架材料中可以直接啟動EBs形成，并且ESC接種濃度對EBs形成具有明顯影響，其最佳

14、接種密度在105個/ml至106個/mL之間。在這一密度范圍內，ESC所形成的EBs數(shù)量多、體積大。在不同支架材料組成對EBs形成與分化的影響研究方面，將ESC分別在單純膠原凝膠及膠原/Matrigel不同體系中培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，支架材料中的膠原凝膠成分主要影響EBs形成，而Matrigel成分則對EBs分化發(fā)育與發(fā)揮重要作用。在ESC自發(fā)分化研究方面，將ESC在膠原/Matrigel三維立體環(huán)境中培養(yǎng)，在不施加任何誘導條件的情況下，通過組織學

15、染色結果表明，體外培養(yǎng)21d后EBs自發(fā)分化形成了與在體結構類似的各種組織結構，如有心肌細胞合胞體樣結構、管腔樣結構形成。針對CK18、CD31、cTnT、Nestin等免疫組織化學染色結果證實，ESC可以分化為cTnT陽性的心肌細胞、CK18陽性的上皮細胞、CD31陽性的內皮細胞以及Nestin陽性細胞等。
　　 第四部分：基于ESC為種子細胞的心肌組織構建及體內移植的實驗研究
　　 在本部分研究中，利用我室在心肌組織

16、工程研究方面既有的研究平臺和技術體系，在前期利用膠原/Matrigel進行ESC定向體外分化研究的基礎上，探索了ESC進一步定向誘導分化并形成心肌組織的能力及其動物心梗修復能力。
　　 ESC在本體系下是否可以通過特定誘導條件而向心肌細胞分化進而形成心肌組織是本論文研究關注的焦點之一。在本部分研究中，通過添加抗壞血酸作為ESC向心肌細胞分化的誘導劑，進行了ESC體外定向誘導分化及心肌組織三維再造研究，并對再造組織進行了組織學及免

17、疫組織化學鑒定。在此基礎上，將所構建的工程化心肌組織移植到心梗部位，觀察其在心梗部位存活、分化，及對心功能的改善情況。
　　 研究發(fā)現(xiàn)ESC在膠原/Matrigel支架材料中培養(yǎng)10-11d時(誘導3-4d)分化形成大量跳動的細胞，并且隨著培養(yǎng)時間的延長，跳動細胞的數(shù)量和面積逐漸增多，14d(誘導7d)左右可見形成大面積跳動區(qū)域，體外培養(yǎng)19d(誘導12d)左右出現(xiàn)一致性跳動區(qū)域。對其進行免疫組織化學染色證實，再造心肌組織中含有

18、大量表達cTnT、Nkx2.5和GATA4陽性的心肌細胞。與向心肌細胞自發(fā)分化相比，誘導分化后cTnT陽性細胞的大量增多，提示抗壞血酸顯著促進了ESC向心肌細胞分化。并且，隨著再造心肌組織中心肌細胞逐漸成熟，可見心肌細胞相互連接部位部分區(qū)域存在Connexin43陽性染色。免疫組織化學染色同時還揭示了在再造心肌組織中存在ESC分化來源的Nestin陽性細胞和CD31陽性細胞。
　　 將上述體外再造心肌組織進行心梗部位移植，并將單

19、純心梗組和非收縮片層移植組作為對照組。移植術后4w進行心功能檢測，結果表明，與單純心梗組和非收縮片層移植組相比，工程化心肌組織移植組可以顯著改善梗死心肌的收縮及舒張功能。組織切片染色觀察顯示工程化心肌組織片層緊密貼附于梗死心肌部位，并已在結構上與宿主心肌發(fā)生整合，兩者之間界限不明顯。此外，針對心肌特異性標志cTnT，Nkx2.5，GATA4，connexin43免疫組織化學檢測結果顯示，再造工程化心肌組織中存在具有分化心肌細胞表型的細胞

20、，并且Connexin43染色結果表明工程化心肌組織及工程化心肌組織與宿主心肌細胞之間形成了較廣泛的細胞間連接。CD31染色結果顯示在移植的工程化心肌組織中存在較豐富的血管內皮細胞，并且形成了管腔樣結構。在此基礎上，對工程化心肌組織移植后畸胎瘤形成情況進行了檢測。移植4w后，開胸觀察畸胎瘤形成。工程化心肌組織移植組移植后會引起畸胎瘤發(fā)生，發(fā)生率在25％(3+/12)，形成的畸胎瘤位于心肌梗死部位，具有一定肉眼可見的體積，而在動物胸腔和腹

21、腔均未檢測到畸胎瘤形成。所形成的畸胎瘤包含典型的三胚層結構。
　　 綜上所述，本論文以膠原/Matrigel為支架材料，在體外建立了三維立體靜態(tài)力學拉伸體系，并利用該體系，以新生大鼠心肌細胞為種子細胞，體外構建了工程化心肌組織片層，并對再造心肌組織中是否存在Telocytes細胞進行研究。此外，通過將血管內皮細胞與心肌細胞復合在膠原/Matrigel支架材料中，進一步研究了再造心肌組織血管化能力。在此基礎上，基于靜態(tài)力學拉伸體系