用大鼠原代心肌細胞在體外構建工程化心肌組織的實驗研究.pdf

1、研究背景：終末期缺血性心臟疾病的治療是目前臨床上尚未克服的難題之一。在我國，隨著人們生活水平的提高，冠心病等的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢，尋找到一個能夠有效地糾正因為心肌梗死造成的心力衰竭、猝死等嚴重后果的治療方法，業(yè)已成為近年來臨床科研工作的重點。而由心肌梗死等原因造成的終末期缺血性心臟疾病的根本原因是有功能的心肌細胞數(shù)量的減少，因此如何恢復或增加有功能心肌細胞的數(shù)量就成為科研的出發(fā)點。為此，人們首先想到了使用細胞移植的方法，通過局部種

2、植或血管灌注等途徑將體外培養(yǎng)的心肌細胞移植到心梗區(qū)域，恢復功能心肌細胞的數(shù)量，現(xiàn)己進入Ⅰ期臨床實驗階段。但到目前為止細胞移植還面臨著很多的問題，首先是種植的細胞存活率較低，與宿主組織的融合性較差，存活下來細胞的實際功能還值得懷疑，因此它的臨床實用價值尚有待觀察。為了克服這些缺點，近年來發(fā)展起來的利用組織工程學的方法構建工程化的心肌組織(engineering heart tissue，EHT)替代壞死的心肌組織，恢復心臟的功能被認為是給

3、終末期缺血性心臟疾病的治療帶來了希望。組織工程學(tissueengineering，TE)是繼遺傳工程學之后新近發(fā)展起來的一門新興的應用科學，是研究開發(fā)用于修復和改善損傷組織結構和功能的生物替代物的一門科學。其核心是模擬體內組織發(fā)生的環(huán)境，建立由細胞和生物材料構成的三維空間復合體，其發(fā)展將會對現(xiàn)代醫(yī)學的基本原則帶來深遠而有意義的影響。它通過應用細胞生物學技術和材料工程學方法在體內和體外進行組織和器官的構建，即將獲得的少量自體細胞在體外

4、進行擴增后，再將這些細胞與具有較強生物可容性和生物可降解性的人工合成共聚物混合，從而形成細胞—支架復合物。而這些共聚物可使細胞在特定的位置種植、固定并生長，為組織的形成提供模板。同時，這種細胞—支架復合物無免疫原性，且擁有和自體組織類似的結構和功能，因此被認為具有廣泛的應用前景。目前實驗已經對不同組織，包括骨、軟骨、肌腱、皮膚，血管和角膜等進行了成功的構建，并已經被臨床用于修復多種組織缺損，取得了令人滿意的效果。組織工程學在心臟外科亦有

5、著廣泛的應用前景，包括構建工程化心肌組織、工程化心臟瓣膜、工程化血管等均成為研究的目標，其中對工程化心臟瓣膜的研究已取得積極的進展，但在工程化心肌組織構建方面的研究才剛剛起步，還面臨著一系列的問題。首先是種子細胞的選擇，如何獲取純度較高的心肌細胞，還需從各種種子細胞中進行篩選；其次是支架材料的選擇，目前應用的材料在生物力學特性上還不能滿足臨床使用的要求，還無法承受左心室巨大壓力的沖擊，因此還有待進一步的研究和改進。本實驗將就EHT的體外

6、構建進行初步的探討。目的探討用大鼠原代心肌細胞和生物可降解材料聚乙醇酸/聚乳酸共聚物(polyglycolic acid and polylactic acid，PLGA)在體外構建工程化心肌組織的可行性。 方法：用0.125％胰蛋白酶和0.01％的EDTA從新生大鼠心臟組織中消化分離出心肌細胞進行體外培養(yǎng)；用多聚L-賴氨酸(PLL)對支架材料PLGA進行修飾，將具有活力的心肌細胞種植于PLGA上并使其固定、生長，構建工程化心肌

7、組織片。應用免疫組織化學和RT-PCR的方法進行心肌細胞鑒定和檢測，并應用掃描電子顯微鏡對細胞-支架復合物進行結構掃描，以及HE染色的方法觀察細胞生長及其與材料的融合情況。 結果：分離后的原代心肌細胞在DMEM營養(yǎng)液中貼壁生長良好，細胞存活率在93％以上，并且具有自發(fā)搏動的能力，以5—14d左右時間內活力最強；利用細胞差時貼壁的原理并在培養(yǎng)液中加用5-Brdu后，心肌細胞純度可達95％以上，并保持有一定的增殖能力。細胞免疫組織化

8、學鑒定α-肌動蛋白(α-Actin)和結蛋白(Desmin)均呈陽性表達，RT-PCR檢測到心肌細胞特異性基因GATA-4和Nkx2.5的表達。在多聚L-賴氨酸的修飾作用下，原代心肌細胞能夠在支架材料PLGA上種植、固定并生長。HE染色及電鏡掃描觀察均見心肌細胞沿支架材料纖維附著生長，分布均勻，相互融合。 結論：原代心肌細胞可以作為組織工程學研究的種子細胞，它能夠在聚酯類支架材料上種植、固定并生長，在體外成功構建工程化的心肌組織