組織工程化肝臟體外構(gòu)建及體內(nèi)移植治療肝衰竭的實驗研究.pdf

1、肝臟疾病嚴重威脅著人類身體健康，目前可行的治療方案主要有以下兩種：肝臟移植與肝細胞移植。這兩種治療方式雖能明顯改善患者癥狀，但也存在很多問題：如肝臟器官移植受到供體器官匱乏、高額費用和長期需要使用免疫抑制劑的限制；肝細胞移植后機體易于產(chǎn)生明顯免疫排斥反應(yīng)，從而導(dǎo)致移植最終失敗。因此，如何尋求新的治療技術(shù)和方法來解決上述問題，逐漸引起國內(nèi)外研究人員的廣泛關(guān)注，組織工程學(xué)的出現(xiàn)為肝病的治療帶來了希望。
　　 組織工程作為一門以“制造

2、和替代人體組織和器官”為主要目的的交叉學(xué)科，在過去二十余年發(fā)展過程中，先后在皮膚、軟骨、神經(jīng)、血管等組織再造領(lǐng)域取得明顯進展，部分組織工程產(chǎn)品已進入市場。針對肝臟的組織工程研究近年來已成為組織工程的熱點領(lǐng)域，發(fā)展尤為迅速，并取得了一系列突破性進展，研究人員利用膠原、殼聚糖、海藻酸鈉等為支架，先后成功在體外再造了工程化肝臟組織。盡管如此，肝臟組織工程研究仍面臨著許多問題和挑戰(zhàn)，例如：如何提高再造肝臟組織的血管化能力以及體內(nèi)移植后如何避免宿

3、主的免疫排斥反應(yīng)等。
　　 本論文分別以膠原/Matrigel和海藻酸微囊作為細胞支架材料，在體外構(gòu)建了三維立體肝臟組織片層以及微囊化肝細胞，并通過在肝細胞-材料復(fù)合體中進一步添加血管內(nèi)皮細胞的方式，促進再造肝臟組織的血管化。研究結(jié)果表明，膠原/Matrigel是肝細胞良好的支架材料，肝細胞在材料內(nèi)能夠形成肝臟組織，并且發(fā)現(xiàn)在肝組織片層中有管腔樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，證實了血管內(nèi)皮細胞對肝細胞功能的促進作用。在微囊化肝細胞研究方面，本論文基

4、于微囊的免疫隔離作用，用微囊共包裹肝細胞與血管內(nèi)皮細胞并對肝衰竭大鼠進行移植治療，通過對大鼠死亡率和肝功能的檢測后發(fā)現(xiàn)，微囊共包裹肝細胞與血管內(nèi)皮細胞可以明顯改善肝衰竭大鼠的肝功能，血管內(nèi)皮細胞的加入對于微囊化肝細胞發(fā)揮生物學(xué)功能起到了積極作用。
　　 本論文從三維立體肝臟組織制造到微囊化肝細胞研究，主要研究內(nèi)容包括以下五個部分：
　　 第一部分：基于膠原/Matrigel的組織工程化肝臟片層體外構(gòu)建研究
　　

5、本部分實驗首先通過改良的膠原酶消化法，原代分離培養(yǎng)鑒定了大鼠肝細胞，并將其培養(yǎng)于膠原/Matrigel基質(zhì)環(huán)境中，構(gòu)建了組織工程化肝臟片層。通過觀察細胞形態(tài)、檢測細胞間的連接以及肝細胞的白蛋白分泌，并與膠原三明治結(jié)構(gòu)相比較，研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)建的肝臟片層中細胞聚集生長，狀態(tài)良好，并且表達actin和E-cadherin連接蛋白，白蛋白的分泌也顯著高于三明治結(jié)構(gòu)，說明膠原/Matrigel基質(zhì)的三維立體環(huán)境更有利于肝細胞的生長和功能的發(fā)揮，體外再

6、造的三維立體肝臟組織對于肝臟疾病的治療及相關(guān)基礎(chǔ)性研究具有重要作用。
　　 第二部分：基于膠原/Matrigel的肝細胞與血管內(nèi)皮細胞三維立體共培養(yǎng)體系的建立
　　 本部分實驗將肝細胞和血管內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)于膠原/Matrigel基質(zhì)環(huán)境中，構(gòu)建了肝細胞/血管內(nèi)皮細胞片層，觀察片層中細胞的形態(tài)、對細胞進行H．E．染色和免疫熒光染色，并且在體外培養(yǎng)1、3、5、7、14d時，更換培養(yǎng)液，收集培養(yǎng)上清，檢測上清培養(yǎng)液中的白蛋白分

7、泌水平。結(jié)果可見肝細胞/血管內(nèi)皮細胞片層中的細胞逐漸聚集生長，組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細胞遷移聚集，形成管腔樣結(jié)構(gòu)。與單純肝細胞片層相比，肝細胞/血管內(nèi)皮細胞片層組培養(yǎng)液中的白蛋白分泌水平明顯高于單純肝細胞組。
　　 第三部分：微囊材料的制備及其生物學(xué)性能評價
　　 在海藻酸鈉一聚賴氨酸-海藻酸(APA)微囊的制備基礎(chǔ)之上，用Ba2+代替Ca2+，制備出海藻酸鋇-聚賴氨酸-海藻酸(BPA)微囊，并采用機械震蕩法測定APA和

8、BPA微囊的機械強度和體外模擬體液法長期培養(yǎng)測定APA和BPA微囊的滲透壓強度，結(jié)果表明，BPA微囊比APA微囊具有較高的機械強度和長期穩(wěn)定性。采用體內(nèi)移植實驗測定微囊在肌肉內(nèi)的移植強度，結(jié)果表明，APA和BPA微囊纖維化程度不明顯。但是，APA微囊移植后體積膨脹率較BPA微囊略大，且成多邊形態(tài)，而BPA微囊的形態(tài)多近似球形。采用腹腔移植實驗測定微囊的生物相容性，結(jié)果表明，大鼠腹腔移植BPA微囊和APA微囊后第7、14、28和56d時，

9、回收的微囊體積均占植入微囊體積的90％以上，光鏡下見回收的兩種微囊絕大部分仍呈完整的球形，表面光滑，無細胞包裹，纖維化程度不明顯。
　　 第四部分：微囊化肝細胞生物學(xué)性能的體外評價
　　 制備BPA微囊化肝細胞，通過對微囊化肝細胞進行組織學(xué)檢測、Live/Dead染色以及測定白蛋白分泌水平，體外評價了肝細胞的活性和功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)過程中光鏡可見微囊和肝細胞均保持完整形態(tài)；組織學(xué)染色與Live/Dead染色結(jié)果顯示微

10、囊內(nèi)大多數(shù)肝細胞仍保持較好活性，肝細胞在BPA微囊內(nèi)培養(yǎng)7d內(nèi)能夠維持穩(wěn)定的白蛋白分泌水平，表明BPA微囊是一種適合于肝細胞生長的微囊材料。
　　 第五部分：微囊共包裹肝細胞和血管內(nèi)皮細胞移植治療大鼠肝衰竭的實驗研究
　　 采用D-氨基半乳糖腹腔注射法建立大鼠急性肝衰竭模型，經(jīng)腹腔移植空微囊、游離的肝細胞、微囊化肝細胞和共包裹肝細胞和血管內(nèi)皮細胞四個實驗組治療肝衰竭大鼠，于移植后的1d、3d、5d、1w、2w、3w、4w

11、眼眥靜脈取血，測血液中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)，白蛋白(ALB)水平，通過對回收微囊的形態(tài)學(xué)檢測和肝衰竭大鼠肝功能檢測發(fā)現(xiàn)，移植4w后回收的BPA微囊形狀完好，纖維化程度不明顯，H．E．染色結(jié)果表明移植4w后囊內(nèi)的肝細胞形態(tài)依舊完整，充分說明了BPA微囊本身的免疫隔離作用保護了肝細胞在移植體內(nèi)的功能發(fā)揮。移植4w內(nèi)共包裹組明顯改善了肝衰竭大鼠的肝功能，其中移植后2到4周，共包裹組大鼠的ALT、AST與ALB水平顯著優(yōu)于

12、其他各組：此外，共包裹組肝衰大鼠死亡率降低，與單純包裹肝細胞組相比，其第四周死亡率由50%減少到20%，表明共包裹組中血管內(nèi)皮細胞維持了肝細胞的活性和功能，延長了肝細胞的存活時間，對大鼠肝衰竭的治療起到了促進作用。
　　 綜上所述，本研究首先在體外構(gòu)建了組織工程化肝細胞片層，并研究了膠原/Matrigel凝膠環(huán)境對于肝細胞的活性和功能發(fā)揮的促進作用，在此基礎(chǔ)上，利用本支架材料體系探討了肝細胞與血管內(nèi)皮細胞的相互作用以及血管內(nèi)皮細