TRPV4通道在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的作用機制研究.pdf

1、第一部分：心肌TRPV4通道在小鼠心肌缺血再灌注損傷中的表達變化及其作用
　　目的：結扎冠狀動脈左前降支（LAD），建立穩(wěn)定的小鼠MIRI模型，研究TRPV4通道在小鼠MIRI中的表達變化規(guī)律，觀察阻斷以及激動TRPV4對小鼠MIRI的影響。
　　方法：建立小鼠MIRI模型，采用Real time-PCR、Western blot及免疫組化的方法動態(tài)觀察缺血再灌后不同時間點（1h，4h，12h，24h，72h，7d）心肌組織

2、TRPV4的表達水平。再灌注后給予TRPV4阻斷劑HC-067047以阻斷MIRI小鼠體內TRPV4的效應，在劑量依賴性研究中，再灌1h后給予不同劑量的TRPV4阻斷劑HC-067047（5,10, and20mg/kg）。在有效治療時間窗的研究中，再灌注后不同時間給予HC-06704710mg/kg（1h，4h，8h，12h，8h/1次）。另外，再灌注后給予TRPV4激動劑4α-PDD1mg/kg和GSK1016790A0.025mg

3、/kg增強MIRI小鼠體內TRPV4的效應。分別于再灌后24h檢測MIRI各項指標，包括伊文思藍和TTC雙染及血清肌鈣蛋白評價危險區(qū)域和梗死面積；超聲心動圖檢測左室射血分數(shù)（EF）和左室短軸縮短率（FS）。
　　結果：小鼠缺血30min再灌注1h后，心肌組織中TRPV4的mRNA和蛋白表達水平開始升高，mRNA水平在24h達到最高，隨后下降。蛋白水平在72h達到高峰，7d時表達下降，但仍然高于假手術組。與 Vehicle組相比，再

4、灌1h后給予不同劑量的TRPV4阻斷劑HC-067047（5，10，20mg/kg），發(fā)現(xiàn)HC-0670475mg/kg即可減小梗死面積和TnT，降低EF值及FS值，而以20mg/kg的治療效果最為顯著。在再灌注后不同時間給予HC-06704710mg/kg（1h，4h，8h，12h），HC-067047均能不同程度的減小心梗面積和TnT，降低EF值及FS值，有效的治療時間窗長達12h。與Vehicle組相比，TRPV4激動劑4α-PD

5、D和GSK1016790A則使小鼠梗死面積增加，EF值及FS值升高。
　　結論：在小鼠MIRI中，TRPV4通道的mRNA和蛋白表達水平表達上調。TRPV4阻斷劑 HC-06704710mg/kg即可減輕 MIRI，且在再灌后12h以內給予 HC-06704710mg/kg治療均能有效緩解MIRI，而TRPV4激動劑4α-PDD和GSK1016790A則加重MIRI。說明TRPV4參與了MIRI的發(fā)生發(fā)展，而阻斷TRPV4有望成為

6、治療MIRI的靶點。
　　第二部分：TRPV4通道與小鼠MIRI誘導的心肌細胞凋亡壞死和炎癥
　　目的：通過建立小鼠 MIRI模型，觀察 TRPV4通道阻斷劑和激動劑干預后對心肌細胞凋亡，ROS和炎癥的影響。
　　方法：將 C57BL/6小鼠分為5組：1）假手術組（Sham組）；2）對照組（給予等量的生理鹽水，Vehicle組）；3）TRPV4阻斷劑HC-067047組（HC-067047組），4）TRPV4激動劑4α

7、-PDD組（4α-PDD組）；5）TRPV4激動劑GSK1016790A組（GSK1016790A組），于再灌注4h后取出心臟，TUNEL染色法檢測心肌細胞凋亡的分布與程度，Western blot檢測抗凋亡蛋白Bcl-2，促凋亡蛋白Bax，Cleaved caspase-3的表達情況。另外，采用DHE法檢測ROS的產(chǎn)生。最后，再灌24h后，免疫組化法檢測中性粒細胞的浸潤。
　　結果：與Sham組相比，Vehicle組心肌細胞凋亡

8、的數(shù)目明顯增多，Cleaved caspase-3的表達增高，抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的比值（Bcl-2/Bax）下降。與Vehicle組相比，TRPV4阻斷劑HC-067047組明顯降低心肌細胞凋亡的各項指標，表現(xiàn)為心肌細胞凋亡數(shù)目的減少，Cleaved caspase-3的表達降低，Bcl-2/Bax比值升高；而TRPV4激動劑4α-PDD組、GSK1016790A組則使心肌細胞凋亡數(shù)目增多，Cleaved caspase-3的表達升

9、高，Bcl-2/Bax比值降低。此外，與Sham組相比，Vehicle組ROS的產(chǎn)生和中性粒細胞的浸潤明顯增多。與Vehicle組相比，HC-067047治療組ROS的產(chǎn)生和中性粒細胞的浸潤顯著減少，而4α-PDD組、GSK1016790A組ROS的產(chǎn)生和中性粒細胞的浸潤顯著增多。
　　結論： TRPV4阻斷劑HC-067047能抑制MIRI時心肌細胞凋亡，ROS的產(chǎn)生和中性粒細胞的浸潤，減輕MIRI。而TRPV4激動劑4α-PD

10、D、GSK1016790A能促進MIRI時心肌細胞凋亡，ROS的產(chǎn)生和中性粒細胞的浸潤。
　　第三部分TRPV4阻斷劑HC-067047改善小鼠MIRI的分子機制
　　目的：通過建立小鼠MIRI模型，觀察TRPV4通道阻斷劑HC-067047對RISK信號通路的影響。
　　方法：將C57BL/6小鼠分為9組：1）假手術組（sham）；2）Vehicle組給予等量的生理鹽水（Vehicle）；3）再灌后1h腹腔注射HC-

11、067047（HC-067047）；4）缺血前1h給小鼠腹腔注射LY294002（LY294002）；5）分別于缺血前1h注射LY294002，再灌后1h注射 HC-067047（LY294002+HC-067047）；6）缺血前1h給小鼠腹腔注射Wortmannin（Wortmannin）；7）分別于缺血前1h注射 Wortmannin，再灌后1h注射HC-067047（Wortmannin+HC-067047）；8）缺血前1h給小鼠

12、腹腔注射U0126（U0126）；9）分別于缺血前1h注射U0126，再灌后1h注射HC-067047（U0126+HC-067047）,于再灌后4h檢測心肌梗死面積和血清中TnT的含量。Western blot檢測假手術組，Vehicle組，HC-067047治療組P-Akt、 P-ERK和P-GSK-3β的水平。
　　結果：與Sham組相比，再灌注4h后，Vehicle組心肌組織P-Akt、P-ERK和P-GSK-3β的蛋白表

13、達水平明顯下降。與Vehicle組相比，HC-067047治療組則明顯增加了心肌組織P-Akt、P-ERK和P-GSK-3β的蛋白表達水平。另外，與Vehicle組相比，HC-067047治療組的梗死面積和TnT均降低，而單獨應用PI3K阻斷劑LY294002，Wortmannin或ERK1/2阻斷劑U0126對梗死面積和TnT無明顯影響。此外，與HC-067047治療組相比，缺血前1h應用PI3K阻斷劑LY294002，Wortman