補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)成骨細(xì)胞增殖、分化，BMP-2表達(dá)及TRPV5-TRPV6通道影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、牙周炎是以牙周袋形成、袋壁炎癥、牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)為主要特征的口腔科常見(jiàn)病，多發(fā)病，牙周炎不僅導(dǎo)致成年人牙齒過(guò)早喪失，并可導(dǎo)致和誘發(fā)各種全身性疾病，嚴(yán)重影響健康。根治牙周炎的關(guān)鍵是通過(guò)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用阻止牙槽骨吸收或促進(jìn)牙槽骨的再生。我科應(yīng)用補(bǔ)腎活血固齒方治療牙周炎，療效顯著，但其作用機(jī)理不明了。骨形成蛋白(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)是骨修復(fù)中最主要的誘導(dǎo)因子，有20多種亞型，其中B

2、MP2的誘導(dǎo)成骨能力較為明顯，BMP2通過(guò)Smads和p38MAPK信號(hào)通路促進(jìn)成骨細(xì)胞表達(dá)多種特異性基因如Ⅰ型膠原、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、骨鈣素，產(chǎn)生相應(yīng)蛋白分泌到細(xì)胞外基質(zhì)中，使細(xì)胞外基質(zhì)礦化，進(jìn)而完成成骨。鈣離子通道TRPV5/TRPV6通過(guò)調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子含量的變化，激活p38MAPK通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化過(guò)程。ALP是成骨細(xì)胞早期分化的標(biāo)志酶，它的活性可以代表成骨細(xì)胞的分化活性和成

3、骨細(xì)胞的分化水平。
　　目的:補(bǔ)腎活血固齒方灌胃大鼠一周，取大鼠含藥血清，作用小鼠顱頂前成骨細(xì)胞（MC3T3-E1細(xì)胞），觀察藥物對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)、增殖、ALP活性，BMP2表達(dá)及TRPV5/TRPV6通道的影響，探討補(bǔ)腎活血固齒方成骨的作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.MC3T3-E1細(xì)胞的培養(yǎng)。
　　2.補(bǔ)腎活血固齒方按體表面積折算等效劑量灌胃大鼠，制備含藥血清;等量生理鹽水灌胃大鼠，制備無(wú)藥血清作為

4、對(duì)照組，10％胎牛血清為空白對(duì)照組。
　　3.用10％含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清分別培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞48h、72h，倒置顯微鏡下觀察補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)的影響。
　　4.MTT法檢測(cè)補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響。
　　10％胎牛血清組、無(wú)藥血清組、含藥血清組（分別含有5％、10％、15％、20％含藥血清），分別培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，MTT法檢測(cè)12h、24h、36h、

5、48h、60h、72h補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響。
　　5.檢測(cè)補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞ALP活性的影響。
　　10％含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清分別培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，檢測(cè)24h、48h、72h時(shí)MC3T3-E1細(xì)胞中ALP的含量。
　　6.RT-PCR法檢測(cè)補(bǔ)腎活血固齒方MC3T3-E1細(xì)胞BMP-2及TRPV5/TRPV6 mRNA表達(dá)影響。
　　10％含藥血清、無(wú)藥血

6、清培養(yǎng)MC3T3-E1細(xì)胞，RT-PCR法檢測(cè)24h、48h、72h的BMP2、TRPV5/TRPV6 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:
　　1.補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)的影響結(jié)果顯示補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯影響。
　　2.補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖的影響結(jié)果顯示含藥血清對(duì)細(xì)胞的增殖無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　3.補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞中ALP活

7、性的影響結(jié)果顯示MC3T3-E1細(xì)胞經(jīng)含藥血清、無(wú)藥血清、胎牛血清組作用后，含藥血清的ALP活性較胎牛血清、無(wú)藥血清增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，并且藥物作用效果顯示時(shí)間依賴效應(yīng)。
　　4.補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞BMP2 mRNA表達(dá)的影響。
　　結(jié)果顯示含藥血清組的BMP2 mRNA表達(dá)量較無(wú)藥血清組增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，并且藥物作用效果顯示時(shí)間依賴效應(yīng)。
　　5.補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)M

8、C3T3-E1細(xì)胞TRPV5/TRPV6 mRNA的表達(dá)的影響結(jié)果顯示含藥血清組的TRPV6 mRNA表達(dá)量較無(wú)藥血清增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)，并且藥物作用效果顯示出時(shí)間依賴效應(yīng)。含藥血清和無(wú)藥血清中MC3T3-E1細(xì)胞均未檢測(cè)到TRPV5 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)論:補(bǔ)腎活血固齒方對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞形態(tài)無(wú)影響;對(duì)MC3T3-E1細(xì)胞增殖活性無(wú)明顯影響;可時(shí)間依賴性增加MC3T3-E1細(xì)胞的ALP活性;可提高M(jìn)C3T