Clostridium ljungdahlii內(nèi)參基因穩(wěn)定性評價及其在重要基因相對表達量研究中的應(yīng)用.pdf

1、由于煤、石油、天然氣等化石燃料的有限性，以及其燃燒排放的CO2造成溫室效應(yīng)和全球變暖，因此尋求新的可再生能源成為目前全球關(guān)注的問題。通過微生物發(fā)酵煉廠排放的含碳(CO、CO2)廢氣可以生產(chǎn)醇類及相關(guān)化工產(chǎn)品，近年來成為人們關(guān)注的焦點之一。Clostridiumljungdahlii（永達爾梭菌）正是這樣一種細(xì)菌，它具有產(chǎn)醇率高、代時短等優(yōu)點而受到廣泛關(guān)注。
　　 C.ljungdahlii基因組數(shù)據(jù)為合成氣(CO、CO2、H2)

2、發(fā)酵研究提供了最基本的分子與遺傳信息，然而合成氣發(fā)酵產(chǎn)醇機理仍然很不清楚，尤其是細(xì)菌的一碳利用途徑、產(chǎn)乙醇途徑以及丁醇耐受性機理。本研究針對這些問題，利用熒光定量PCR方法以及轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)研究重要基因的功能，并篩選出不同碳源及不同溶劑脅迫條件下培養(yǎng)的C.ljungdahlii中表達穩(wěn)定的內(nèi)參基因，為后續(xù)開展的分子生物學(xué)研究提供理論依據(jù)。
　　 分別以CO/CO2和果糖作碳源培養(yǎng)C.ljungdahlii，測得該細(xì)菌在兩種碳源的培

3、養(yǎng)基中的生長曲線和產(chǎn)物乙醇、乙酸含量，其中果糖作碳源時細(xì)菌在10小時左右進入對數(shù)生長時期，最終OD600為0.85，乙醇、乙酸的最高產(chǎn)量分別是22.4mM，31.0mM。CO/CO2作碳源時細(xì)菌在50小時進入對數(shù)生長時期，最終OD600為0.85，乙醇、乙酸的最高產(chǎn)量分別是22.7mM，74.8mM。
　　 本試驗應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)研究了七個候選內(nèi)參基因在不同碳源及不同溶劑脅迫條件下培養(yǎng)C.ljungdahlii時的表達穩(wěn)定

4、性，結(jié)果表明，gyrA，rho，fotl的表達是最穩(wěn)定的，這三個基因可以用于校正C.ljungdahlii中目的基因的熒光定量PCR數(shù)據(jù)。本試驗首次研究了C.ljungdahlii中候選內(nèi)參基因的穩(wěn)定性，找到了可以用于校正目的基因表達量以及轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的內(nèi)參基因，為后續(xù)的分子生物學(xué)研究提供了基礎(chǔ)。
　　 結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)研究了參與一碳固定途徑、乙醇合成途徑、氮代謝途徑、雙組分系統(tǒng)、維生素合成途徑以及細(xì)菌趨化性

5、相關(guān)的重要基因在不同碳源培養(yǎng)條件下表達差異性，其中三種碳饑餓蛋白基因在CO/CO2作碳源培養(yǎng)的細(xì)菌中的表達量顯著上調(diào);參與wood-ljungdahl途徑的亞甲基四氫葉酸還原酶基因在CO/CO2作碳源培養(yǎng)的細(xì)菌中的表達量也顯著升高;參與果糖代謝途徑的幾個基因（pfk6、tim,gap）在CO/CO2作碳源培養(yǎng)的細(xì)菌中的表達量則顯著低于果糖作碳源培養(yǎng)的細(xì)菌中的表達量。另外，本試驗研究的參與氮代謝途徑、雙組分系統(tǒng)、維生素合成途徑以及細(xì)菌趨化