酸性普魯蘭酶基因分子改良表達(dá)及其熱穩(wěn)定性研究.pdf

1、普魯蘭酶是一類應(yīng)用價(jià)值很高的淀粉脫支酶，但是從自然界分離得到的天然菌株，分泌普魯蘭酶的能力有限，難以大規(guī)模應(yīng)用在工業(yè)化生產(chǎn)中。利用基因工程技術(shù)，可以改善普魯蘭酶的酶學(xué)性質(zhì)和蛋白分泌表達(dá)水平。為了獲得酶學(xué)性質(zhì)更加優(yōu)良的酶蛋白和進(jìn)一步提高普魯蘭酶的表達(dá)水平，研究人員開始對(duì)普魯蘭酶蛋白的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，并且通過計(jì)算模擬設(shè)計(jì)對(duì)酶蛋白進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)研究。
　　本研究將來源于Bacillus naganoensis(ATCC53909)的普

2、魯蘭酶基因轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，重組酶最適溫度60℃，最適pH4,該酶非常適合在淀粉工業(yè)加工中應(yīng)用，與其他的糖化酶配合使用，來提高淀粉酶的利用效率。但是，該酶的熱穩(wěn)定性較差，在60℃保溫10min酶活性完全喪失，阻礙了其應(yīng)用。因此提高Pul的熱穩(wěn)定性是本研究的重點(diǎn)。
　　通過查閱文獻(xiàn)和序列比對(duì)，找到了四條和來源于Pullulanibacillus naganoensis的普魯蘭酶相似性較高的酸性普魯蘭酶序列，依據(jù)同源建模對(duì)普

3、魯蘭酶Pul的不同結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行N端或者C端刪除突變，最后確定刪除的位置。截短得到的突變體中只有Pul-D1F保持優(yōu)良的酶學(xué)性質(zhì)，蛋白表達(dá)較好，最適溫度與野生酶Pul相同，都是60℃，且最適pH4.5，滿足淀粉加工應(yīng)用的pH范圍。但是進(jìn)一步的N端或C端截短普魯蘭酶活性完全喪失，說明這些結(jié)構(gòu)域?qū)S持酶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能具有重要作用。
　　在Pul-D1F的基礎(chǔ)上進(jìn)行定點(diǎn)突變，將構(gòu)建的9個(gè)突變體在60℃保溫0、2、5、10、20、30、

4、40、50、60min后， N387D的熱穩(wěn)定性最好，其次是D328H和A414P，這三個(gè)點(diǎn)在60℃保溫20min后的殘余酶活分別為58.32％、48.37%、13.06%。由于多點(diǎn)突變通常情況下比單點(diǎn)突變對(duì)蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性影響更大，為了進(jìn)一步提高普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性，對(duì)熱穩(wěn)定性較好的三個(gè)單點(diǎn)N387D、D328H和A414P，進(jìn)行兩點(diǎn)及三點(diǎn)的組合突變，所得的突變體A414P/N387D/D328H的熱穩(wěn)定性最好，其次是N387D/D32