酸性普魯蘭酶基因分子改良表達及其熱穩(wěn)定性研究.pdf

1、普魯蘭酶是一類應用價值很高的淀粉脫支酶，但是從自然界分離得到的天然菌株，分泌普魯蘭酶的能力有限，難以大規(guī)模應用在工業(yè)化生產(chǎn)中。利用基因工程技術，可以改善普魯蘭酶的酶學性質和蛋白分泌表達水平。為了獲得酶學性質更加優(yōu)良的酶蛋白和進一步提高普魯蘭酶的表達水平，研究人員開始對普魯蘭酶蛋白的分子結構進行解析，并且通過計算模擬設計對酶蛋白進行了酶學性質研究。
　　本研究將來源于Bacillus naganoensis(ATCC53909)的普

2、魯蘭酶基因轉入大腸桿菌中進行誘導表達，重組酶最適溫度60℃，最適pH4,該酶非常適合在淀粉工業(yè)加工中應用，與其他的糖化酶配合使用，來提高淀粉酶的利用效率。但是，該酶的熱穩(wěn)定性較差，在60℃保溫10min酶活性完全喪失，阻礙了其應用。因此提高Pul的熱穩(wěn)定性是本研究的重點。
　　通過查閱文獻和序列比對，找到了四條和來源于Pullulanibacillus naganoensis的普魯蘭酶相似性較高的酸性普魯蘭酶序列，依據(jù)同源建模對普

3、魯蘭酶Pul的不同結構域分別進行N端或者C端刪除突變，最后確定刪除的位置。截短得到的突變體中只有Pul-D1F保持優(yōu)良的酶學性質，蛋白表達較好，最適溫度與野生酶Pul相同，都是60℃，且最適pH4.5，滿足淀粉加工應用的pH范圍。但是進一步的N端或C端截短普魯蘭酶活性完全喪失，說明這些結構域對維持酶蛋白的結構和功能具有重要作用。
　　在Pul-D1F的基礎上進行定點突變，將構建的9個突變體在60℃保溫0、2、5、10、20、30、

4、40、50、60min后， N387D的熱穩(wěn)定性最好，其次是D328H和A414P，這三個點在60℃保溫20min后的殘余酶活分別為58.32％、48.37%、13.06%。由于多點突變通常情況下比單點突變對蛋白質的熱穩(wěn)定性影響更大，為了進一步提高普魯蘭酶的熱穩(wěn)定性，對熱穩(wěn)定性較好的三個單點N387D、D328H和A414P，進行兩點及三點的組合突變，所得的突變體A414P/N387D/D328H的熱穩(wěn)定性最好，其次是N387D/D32