假單胞菌中Red-ET重組系統(tǒng)的構建與應用.pdf

1、假單胞菌屬（Pseudomonas）是假單胞菌科的一屬，屬于γ-變形菌綱，是分布最廣的微生物之一。假單胞菌生存環(huán)境的多樣性造就了假單胞菌多種多樣的營養(yǎng)代謝類型，同時也為提供了豐富的遺傳資源。隨著基因組工程的發(fā)展，完成全基因組測序的假單胞菌種類越來越多，預測的次級代謝產物種類比較豐富，其中惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida）銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginoda），熒光假單胞菌(Pseudomonas

2、fluorescens)和丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae)是常見的幾種假單胞菌，惡臭假單胞菌可以降解有機污染物，對環(huán)境進行生物修復，改造與有機污染物降解相關的基因是構建降解工程菌的基礎;熒光假單胞菌是植物促生菌，可以在植物根部定植，產生對植物病原菌有拮抗作用的次生代謝產物;丁香假單胞菌是植物致病菌，染色體上的毒力島基因簇中有致病因子的合成基因，通過對致病基因的改造可以更深入研究其致病機制;銅綠假單胞菌是人類的條件

3、致病菌，其抗感染治療面臨嚴重的耐藥性問題。減毒活疫苗是一種有效的銅綠假單胞菌感染治療方法，減毒的銅綠假單胞菌需要通過基因工程方法改造獲得。但是假單胞菌的幾種模式菌株中還沒有有效的遺傳操作方法，本課題在Red/ET同源重組技術的基礎上，根據假單胞菌自身噬菌體的重組蛋白構建一套新型高效簡捷的遺傳操作體系，并利用新型的遺傳操作體系對假單胞菌基因組進行遺傳修飾改造。
　　以Red/ET同源重組技術為基礎，構建一系列遺傳操作系統(tǒng)。在假單胞菌

4、和其噬菌體基因組中尋找大腸桿菌噬菌體λRed操縱子或者大腸桿菌Rac前噬菌體RecET操縱子類似的同源蛋白，BLAST顯示銅綠假單胞菌噬菌體vB_ PaeP_Tr60_Ab31中有與λRed類似的操縱子（Orf38，Orf37和Orf36），來自丁香假單胞菌B728a原噬菌體(Pseudomonas syringae pv.syringae B728a)中有與RecET類似的操縱子(RecTEpsy)，分析顯示Orf38類似于單鏈退火蛋

5、白Redβ，Orf37類似于5'-3'的核酸外切酶Redα，Orf36類似于大腸桿菌DNA單鏈結合蛋白(SSB)，以這兩個操縱子為基礎構建一系列的遺傳操作系統(tǒng)。
　　比較選擇不同假單胞菌中最佳的遺傳操作系統(tǒng)，利用最佳的遺傳操作系統(tǒng)在不同假單胞菌中進行基因修飾。將構建的一系列遺傳操作系統(tǒng)轉入常見的假單胞菌惡臭假單胞菌、銅綠假單胞菌、熒光假單胞菌和丁香假單胞菌，比較這些遺傳操作系統(tǒng)在不同假單胞菌的重組效率，確定不同菌最佳的遺傳操作系統(tǒng)

6、。功能檢測結果表明，λRed類似的操縱子和RecET類似的操縱子與Redγ/Pluγ組成的雜合遺傳操作系統(tǒng)能夠在假單胞菌中工作，并且SSB蛋白可以顯著的提高重組效率。通過比較與鑒定，分別挑選到了不同假單胞菌的最佳重組系統(tǒng)，成功對假單胞菌進行基因組的修飾，并與反向篩選標記共同作用對基因組進行無痕修飾，包括插入啟動子和突變致病基因。
　　在假單胞菌中建立和優(yōu)化新型遺傳操作系統(tǒng)，可方便、快捷地對假單胞菌進行遺傳操作，構建的系統(tǒng)包括DNA

7、雙鏈核酸外切酶，DNA單鏈退火蛋白、宿主核酸外切酶抑制蛋白和宿主的單鏈結合蛋白。反應底物雙鏈DNA可以通過一步PCR獲得，進行遺傳操作時一步重組得到需要的重組子，周期短效果明顯，促進了假單胞菌和其他相關菌株的功能基因組學研究。
　　銅綠假單胞菌噬菌體中的SSB蛋白能有效提高假單胞菌和大腸桿菌的重組效率。在研究假單胞菌的遺傳操作系統(tǒng)時，發(fā)現來自于銅綠假單胞菌噬菌體的SSB蛋白在遺傳操作系統(tǒng)中有比較重要的作用，在銅綠假單胞菌和大腸桿菌

8、中，噬菌體vB PaeP_Tr60_Ab31的SSB蛋白與Redγ蛋白共表達可以提高遺傳操作系統(tǒng)的重組效率。但是在本課題研究中SSB蛋白沒有消除DNA雙鏈二級結構的作用，還需要更進一步的研究來揭示SSB蛋白提高重組效率的機理。
　　本課題是針對假單胞菌建立一系列新型、高效的遺傳修飾系統(tǒng)。利用新型重組系統(tǒng)在假單胞菌中成功進行了一系列遺傳修飾，包括進行點突變和與反向篩選標記結合的無痕修飾等。本課題構建的新型重組系統(tǒng)可以促進假單胞菌和其