銅綠假單胞菌隨機啟動子庫的構(gòu)建及其應(yīng)用.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種革蘭氏陰性條件致病菌，可以在人群中引起嚴重的急性和慢性感染，是病人在醫(yī)院期間發(fā)生感染的第三大致病菌，而且銅綠假單胞菌的一個重要特性是它對許多抗生素具有很高的內(nèi)在抗藥性。因此研究銅綠假單胞菌的致病性和抗藥性機制具有重要的現(xiàn)實意義。 鐵對幾乎所有的微生物來說是一種必需的營養(yǎng)元素，對革蘭氏陰性致病菌的毒性作用也是必需的。在銅綠假單胞菌全基因組水平上對鐵感應(yīng)基因的研究，可

2、以系統(tǒng)了解銅綠假單胞菌的鐵代謝及鐵調(diào)控途徑、有助于了解假單胞菌進入宿主后基因表達的變化。 抗生素是一種生物活性物質(zhì)，最新研究表明抗生素除作為殺菌物質(zhì)以外，還作為微生物間的信號物質(zhì)調(diào)節(jié)微生物基因的表達。低抑制濃度的抗生素可以調(diào)節(jié)致病因子的表達，誘導(dǎo)病原菌的抗藥性，影響微生物群體中細胞l白]的相互作用以及微生物與寄主的相互作用。因此，在全基因組水平上研究低抑制濃度抗生素的調(diào)控作用，對于深入了解抗生素的生物學意義，揭示基因調(diào)控的潛在途

3、徑有重要意義。 本研究采用以缺失啟動子的LuxCDABE為報道子的質(zhì)粒pMS402為載體，構(gòu)建了由大約5700個克隆組成的銅綠假單胞菌隨機啟動子庫，建立了特定條件下篩選銅綠假單胞菌全基因組基因表達變化的高通量平臺。針對鐵這種幾乎所有微生物都必需的，對病原菌尤為重要的營養(yǎng)元素，在全基因組水平上檢測了銅綠假單胞菌的鐵感應(yīng)基因，結(jié)果驗證了2個已知的受鐵調(diào)控的基因，并發(fā)現(xiàn)了尚未報道的二氫葉酸還原酶，磷酸葡萄糖脫水酶和檸檬酸鐵轉(zhuǎn)運蛋白受鐵

4、調(diào)控的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)與鐵調(diào)控相關(guān)的4個功能未知的基因和3個假定蛋白的基因，研究結(jié)果對于闡明鐵在銅綠假單胞菌中的調(diào)控作用，揭示鐵對細菌生理及致病性的作用機制提供了理論基礎(chǔ)。根據(jù)測定的羧芐青霉素、多粘菌素和環(huán)丙沙星對銅綠假單胞菌的抑制濃度，用低于抑制濃度的三種抗生素分別對銅綠假單胞菌的部分隨機啟動子庫進行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了乙酰輔酶A脫氫激酶、溶血磷脂酸受低抑制濃度環(huán)丙沙星調(diào)節(jié)的現(xiàn)象以及1個功能未知基因受低抑制濃度羧芐青霉素調(diào)節(jié)的現(xiàn)象，研究結(jié)果對