銅綠假單胞菌隨機(jī)啟動子庫的構(gòu)建及其應(yīng)用.pdf

1、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一種革蘭氏陰性條件致病菌，可以在人群中引起嚴(yán)重的急性和慢性感染，是病人在醫(yī)院期間發(fā)生感染的第三大致病菌，而且銅綠假單胞菌的一個(gè)重要特性是它對許多抗生素具有很高的內(nèi)在抗藥性。因此研究銅綠假單胞菌的致病性和抗藥性機(jī)制具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 鐵對幾乎所有的微生物來說是一種必需的營養(yǎng)元素，對革蘭氏陰性致病菌的毒性作用也是必需的。在銅綠假單胞菌全基因組水平上對鐵感應(yīng)基因的研究，可

2、以系統(tǒng)了解銅綠假單胞菌的鐵代謝及鐵調(diào)控途徑、有助于了解假單胞菌進(jìn)入宿主后基因表達(dá)的變化。 抗生素是一種生物活性物質(zhì)，最新研究表明抗生素除作為殺菌物質(zhì)以外，還作為微生物間的信號物質(zhì)調(diào)節(jié)微生物基因的表達(dá)。低抑制濃度的抗生素可以調(diào)節(jié)致病因子的表達(dá)，誘導(dǎo)病原菌的抗藥性，影響微生物群體中細(xì)胞l白]的相互作用以及微生物與寄主的相互作用。因此，在全基因組水平上研究低抑制濃度抗生素的調(diào)控作用，對于深入了解抗生素的生物學(xué)意義，揭示基因調(diào)控的潛在途

3、徑有重要意義。 本研究采用以缺失啟動子的LuxCDABE為報(bào)道子的質(zhì)粒pMS402為載體，構(gòu)建了由大約5700個(gè)克隆組成的銅綠假單胞菌隨機(jī)啟動子庫，建立了特定條件下篩選銅綠假單胞菌全基因組基因表達(dá)變化的高通量平臺。針對鐵這種幾乎所有微生物都必需的，對病原菌尤為重要的營養(yǎng)元素，在全基因組水平上檢測了銅綠假單胞菌的鐵感應(yīng)基因，結(jié)果驗(yàn)證了2個(gè)已知的受鐵調(diào)控的基因，并發(fā)現(xiàn)了尚未報(bào)道的二氫葉酸還原酶，磷酸葡萄糖脫水酶和檸檬酸鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白受鐵

4、調(diào)控的現(xiàn)象，發(fā)現(xiàn)與鐵調(diào)控相關(guān)的4個(gè)功能未知的基因和3個(gè)假定蛋白的基因，研究結(jié)果對于闡明鐵在銅綠假單胞菌中的調(diào)控作用，揭示鐵對細(xì)菌生理及致病性的作用機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。根據(jù)測定的羧芐青霉素、多粘菌素和環(huán)丙沙星對銅綠假單胞菌的抑制濃度，用低于抑制濃度的三種抗生素分別對銅綠假單胞菌的部分隨機(jī)啟動子庫進(jìn)行了篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了乙酰輔酶A脫氫激酶、溶血磷脂酸受低抑制濃度環(huán)丙沙星調(diào)節(jié)的現(xiàn)象以及1個(gè)功能未知基因受低抑制濃度羧芐青霉素調(diào)節(jié)的現(xiàn)象，研究結(jié)果對