茶樹(shù)4CL基因的克隆及功能驗(yàn)證.pdf

1、在植物體內(nèi)，苯丙烷代謝是一條重要的次生代謝途徑，涉及到木質(zhì)素、黃酮類(lèi)化合物以及花青素等多種代謝產(chǎn)物的生物合成。4香豆酸輔酶A連接酶（4CL）處于苯丙烷代謝途徑與木質(zhì)素合成以及類(lèi)黃酮途徑結(jié)合的分支點(diǎn)上，對(duì)植物次生代謝產(chǎn)物的生物合成具有重要的調(diào)控作用。
　　本研究克隆了2條茶樹(shù)4CL基因（Cs4CL）；利用原核表達(dá)技術(shù)、HPLC和UPLC-MS鑒定技術(shù)以及紫外分光光度檢測(cè)技術(shù)，驗(yàn)證了融合蛋白Cs4CL的功能；構(gòu)建Cs4CL植物過(guò)表達(dá)載

2、體，轉(zhuǎn)化了煙草和擬南芥。
　　主要研究結(jié)果如下：
　　1．從NCBI和安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組中篩選出兩條Cs4CL基因的EST序列，利用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆得到茶樹(shù)兩條Cs4CL基因。利用DNAMAN軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)Cs4CL1和Cs4CL2的氨基酸一致性為62.63％，它們都具有植物4CL蛋白高度保守的基序Box I和 Box II。對(duì)其進(jìn)行進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)兩條Cs4CL基因分別屬于兩個(gè)不同的亞組。
　　

3、2.利用原核表達(dá)體系，對(duì)Cs4CL1和Cs4CL2進(jìn)行了原核表達(dá)。構(gòu)建了petSUMO-Cs4CL1和petSUMO-Cs4CL2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化Escherichia coli.BL21表達(dá)菌株。誘導(dǎo)表達(dá)后，對(duì)Cs4CL1與Cs4CL2融合蛋白進(jìn)行了分離純化，得到重組蛋白。利用HPLC及UPLC-MS檢測(cè)技術(shù)，對(duì)Cs4CL1與Cs4CL2融合蛋白進(jìn)行酶活檢測(cè)及產(chǎn)物鑒定，發(fā)現(xiàn)兩種重組蛋白均具有催化活性。
　　3．利用紫外分光光度檢測(cè)

4、技術(shù)，研究了 Cs4CL1與 Cs4CL2重組蛋白的最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH，酶的穩(wěn)定特征，以及底物特異性。結(jié)果表明：Cs4CL1的最適反應(yīng)pH為6.5，最適溫度為50℃；最適穩(wěn)定溫度為0℃，pH為7.0；最適底物為咖啡酸。Cs4CL2最適反應(yīng)pH為7.5，最適溫度為50℃；最適穩(wěn)定溫度為-20℃，pH為6.0；最適底物為香豆酸。
　　4．構(gòu)建了植物過(guò)表達(dá)載體 pCB2004-Cs4CL1和 pCB2004-Cs4CL2，對(duì)其進(jìn)