基于微流控芯片的脂質(zhì)體制備及電穿孔實驗.pdf

1、脂質(zhì)體是磷脂分子有序排列閉合形成內(nèi)腔為空心的圓球型聚集體。由于磷脂的分子結(jié)構(gòu)包括親水的頭基和疏水的長鏈，故形成的脂質(zhì)體同樣具有兩親性。其內(nèi)部空腔可加載親水性的物質(zhì)，疏水鏈之間加載親油性的物質(zhì)。目前脂質(zhì)體的應(yīng)用主要有以下兩個方面:藥物載體和人工細胞模型。傳統(tǒng)制備方法得到的脂質(zhì)體粒徑不均勻，穩(wěn)定性較差，需要通過二次處理才能得到粒徑均一的脂質(zhì)體，但這會降低脂質(zhì)體的利用率;作為人工細胞模型，常用電轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入外源物質(zhì)，用以模擬真實細胞的生命活

2、動。但是常規(guī)的電轉(zhuǎn)染往往需要較高的電壓，且不能動態(tài)監(jiān)測轉(zhuǎn)染過程。微流控芯片的產(chǎn)生為上述兩個問題的解決提供了途徑。
　　本課題以微流控芯片為主體，搭建了脂質(zhì)體制備平臺和電穿孔動態(tài)監(jiān)測平臺。得到的研究結(jié)果如下:
　　(1)微流控芯片的仿真模擬與制作。應(yīng)用Gambit建立芯片內(nèi)部的結(jié)構(gòu)模型，再用Flunet進行流場模擬。主要考察的因素有微通道的寬度，入口角度以及側(cè)通道的流速。以中央通道流體在混合流體所占的體積比例為參考指標，得出在

3、微通道的寬度為100μm，入口角度為90°時流體的混合效率最好，側(cè)通道與中央通道的臨界流速比為10。
　　(2)基于微流控聚焦力學(xué)的方法制備脂質(zhì)體。以1-棕櫚?；?2-油酰-SN-甘油-3-磷酰膽堿(POPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿(DMPC)為原料，分別考察了不同因素對形成的脂質(zhì)體粒徑及穩(wěn)定性的影響，并用理論公式予以解釋說明。在脂質(zhì)體粒徑方面，考察了側(cè)通道與中央通道體積流速比FRR值、溫度及膽固醇含量的影響:低FRR值時，得到的

4、脂質(zhì)體粒徑較大(900nm～1600nm)但其粒徑分布較寬。而在高FRR值時，得到的粒徑較小，且多分散性較好。脂質(zhì)體粒徑隨著FRR的增加而減小;在20℃～50℃區(qū)間內(nèi)，隨著溫度的上升脂質(zhì)體粒徑有下降的趨勢。但DMPC磷脂在23℃時粒徑突然增大，這是由于達到了磷脂相變溫度使得膜的彈性模量增大了3～5倍;膽固醇的添加量使得粒徑增大，且在摩爾比為20％的粒徑最大。通過正交實驗得到FRR值對脂質(zhì)體粒徑的影響最大，當FRR=4、溫度為20℃、膽固

5、醇添加量為20％時得到的脂質(zhì)體粒徑為276.8±3.2nm，且均一性較好。在脂質(zhì)體穩(wěn)定性方面:高濃度磷脂形成的脂質(zhì)體穩(wěn)定性高于低濃度的;表面活性劑的添加在不影響粒徑的前提下大大提高了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，其中陽離子表面活性劑十二烷基三甲基氯化銨與POPC磷脂按摩爾比10％復(fù)配制得的脂質(zhì)體Zeta電位在13.6±0.54mV和26±1.83mV之間，陰離子表面活性劑十六烷基磷酸鉀與POPC磷脂復(fù)配得到的脂質(zhì)體Zeta電位在-27.38±1.1m

6、V和-32.8±0.39mV之間;膽固醇的添加使脂質(zhì)體穩(wěn)定性增強，在20％的添加量時Zeta電位達到-44.74±0.95mV。此外，還利用CLSM、TEM觀察了不同F(xiàn)RR值下形成脂質(zhì)體的微觀結(jié)構(gòu)。
　　(3)基于激光共聚焦實時監(jiān)測的電穿孔實驗。以脂質(zhì)體和酵母細胞為實驗對象實現(xiàn)低電壓下的電穿孔。脂質(zhì)體體系:NBD-PE和POPC以0.1％的摩爾比制備形成熒光脂質(zhì)體，在100V、脈沖寬度為200ms、脈沖形式為單脈沖的條件下，在CL

7、SM下選定ROI，觀察熒光強度隨時間變化曲線。由計算得出的理論跨膜電壓是375mV，低于擊穿膜的臨界跨膜電壓，電穿孔沒有成功;酵母細胞體系:用細胞膜紅色熒光探針標記酵母細胞，施加相同的電壓以及脈沖寬度，其熒光強度也沒有發(fā)生明顯的變化。為了探究電穿孔成功與否，用8μM的羧基水溶性CdSe/ZnS量子點非特異性標記酵母細胞，選定細胞膜為ROI1，在細胞膜極點位置為ROI2，在100V、脈沖寬度為200ms，單脈沖的條件下實現(xiàn)了細胞的電穿孔。