豬成纖維細(xì)胞脂質(zhì)體或電穿孔轉(zhuǎn)染pEGFP-N1條件的優(yōu)化.pdf

1、我國是世界養(yǎng)豬第一大國，擁有豐富的地方豬種遺傳資源，但是由于對本地和引進(jìn)優(yōu)良種豬的特色性能的發(fā)掘、利用效率和保護(hù)等工作相對薄弱、繁育工作滯后，均直接導(dǎo)致了良種基因資源沒有被充分利用，嚴(yán)重制約了我國養(yǎng)豬生產(chǎn)的水平和效益，與世界養(yǎng)豬第一大國的位置很不相稱。因此，以我國地方豬種遺傳資源為基礎(chǔ)，借助體細(xì)胞克隆、轉(zhuǎn)基因、胚胎移植等現(xiàn)代生物技術(shù)，豐富資源保護(hù)、新品種培育手段，提高本地豬種利用率，實現(xiàn)本土化供種，減少引種數(shù)量，打破長期依賴從國外引種的

2、怪圈，是我國養(yǎng)豬業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待攻克的重要課題之一。此外，開展豬體細(xì)胞克隆及轉(zhuǎn)基因克隆研究不僅對畜牧業(yè)具有重大推動作用，也將為人類醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究提供理想的動物模型。但是，轉(zhuǎn)基因克隆豬的生產(chǎn)程序復(fù)雜、成本高、效率低下等不足制約著這一技術(shù)直接造福于人類。故此，為了利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)豐富地方豬種遺傳資源保護(hù)手段，以及為轉(zhuǎn)基因克隆豬生產(chǎn)提供豐富的體細(xì)胞素材，為創(chuàng)制豬轉(zhuǎn)基因育種新材料奠定基礎(chǔ)，本研究開展了以下實驗：
　　 實驗一以出生后3

3、0日齡的安慶六白豬耳部皮膚組織和處于妊娠期第40天左右的梅山豬胎兒組織為材料，采取組織塊接種培養(yǎng)法或胰蛋白酶消化法分離培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，并對所獲得的細(xì)胞系的體外培養(yǎng)生物學(xué)特性進(jìn)行了檢測，包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和生長曲線繪制。結(jié)果表明：所獲安慶六白豬和梅山豬的細(xì)胞系符合成纖維細(xì)胞的基本特征：細(xì)胞貼壁生長狀態(tài)呈典型的梭型、星型或多邊形，細(xì)胞之間連接緊密，成片生長，生長曲線呈典型的“S”狀。通過組織塊接種培養(yǎng)法或胰蛋白酶消化法，本試驗共成功建立了4

4、 頭雄性安慶六白豬和15頭梅山豬胎兒的19個成纖維細(xì)胞系，為后續(xù)研究提供的豐富的材料。
　　 實驗二以實驗一建立的梅山豬胎兒成纖維細(xì)胞系（pig fetal fibroblasts cells,PFCs）為材料，探討以脂質(zhì)體介導(dǎo)pEGFP-N1 轉(zhuǎn)染梅山豬胎兒成纖維細(xì)胞的最佳條件，具體研究了脂質(zhì)體（LipofectaminTM 2000）和質(zhì)粒（pEGFP-N1）DNA的比例、細(xì)胞密度、轉(zhuǎn)染試劑盒處理細(xì)胞時間、血清添加與否等。發(fā)

5、現(xiàn)在6 孔板體系下，用Lip ofectamine TM 2000 轉(zhuǎn)染梅山豬成纖維細(xì)胞系當(dāng)細(xì)胞密度為80-90％時，質(zhì)粒pEGFP-N1 為4μg，LipofectamineTM 2000 加樣量為8μl，轉(zhuǎn)染過程中不含雙抗和血清，在轉(zhuǎn)染5小時后換上新鮮的不含抗生素的培養(yǎng)基，在此條件下，梅山豬轉(zhuǎn)pEGFP-N1的效果最佳，轉(zhuǎn)染效率約為30％-40％。
　　 實驗三首先比較了梅山豬胎兒不同個體PFCs 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pEGFP-N1

6、的效率。
　　 用實驗二優(yōu)化的轉(zhuǎn)染方案對不同梅山豬轉(zhuǎn)基因情況進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)No.6和No.13豬的PFCs 轉(zhuǎn)染效率較高；其次，為探索建立兩基因共轉(zhuǎn)PFCs的方案，我們用Lipofectamine TM 2000 將pEGFP-N1和DsRed 兩個商業(yè)化載體共同轉(zhuǎn)染PFCs，發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩個載體各為3μg 時，轉(zhuǎn)染效果最佳，而且所獲PFCs表達(dá)綠色熒光時并不都表達(dá)紅色熒光，但表達(dá)紅色熒光的PFCs 卻都表達(dá)綠色熒光。
　　

7、 實驗四摸索了梅山豬PFCs 電穿孔轉(zhuǎn)染條件。采用BTX 電轉(zhuǎn)儀和InvitrogenNeonTM 電轉(zhuǎn)儀對梅山豬PFCs 進(jìn)行電轉(zhuǎn)pEGFP-N1。以電擊2d后的細(xì)胞存活率、發(fā)綠光比例為綜合判定參數(shù)優(yōu)劣。發(fā)現(xiàn)使用BTX 電轉(zhuǎn)儀的最佳參數(shù)為：場強(qiáng)170V/cm、脈沖時間15ms、脈沖1 次；Invitrogen NeonTM的最優(yōu)參數(shù)為：場強(qiáng)1400V/cm、脈沖時間30ms、脈沖1 次。
　　 實驗五以脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染所獲表達(dá)p

8、EGFP-N1的梅山豬PFCs 為供核生產(chǎn)克隆胚，并1-2細(xì)胞期的克隆胚移植給代孕母豬體內(nèi)，200 枚/頭，共移植19 頭受體，其中1 頭受體懷孕期滿產(chǎn)下4 頭克隆豬，經(jīng)PCR檢測有3 頭克隆仔豬攜帶EGFP基因。
　　 總之，本研究集成了組織塊法、胰蛋白酶消化法及玻璃化冷凍技術(shù)，在豬上首次通過組織塊胰蛋白酶消化、冷凍再復(fù)蘇接種法建立了梅山豬PFCs；篩選出適于梅山豬PFCs的脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因方案，并成功獲得轉(zhuǎn)基因克隆豬；通過脂