膽固醇代謝qPCR array檢測方案的建立及其應(yīng)用.pdf

1、糖尿病患者往往存在血脂異常，是動脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素。血脂異?？梢约铀賱用}粥樣硬化的形成和進(jìn)展，增加糖尿病大血管病變的發(fā)生與發(fā)展。然而機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)代謝是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的生物過程，涉及到一系列的基因，糖尿病脂質(zhì)代謝紊亂的發(fā)生機(jī)制尚不清楚。目前，研究基因表達(dá)差異的技術(shù)主要有表達(dá)譜芯片，RNA測序，熒光定量PCR等。但是這三種方法都各有缺點(diǎn):表達(dá)譜芯片中并沒有準(zhǔn)確的定量信息，結(jié)果需要大量的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證;表達(dá)譜芯片是一種廣譜的篩選方法，其并沒有針對性研

2、究基因，許多與研究對象無關(guān)的基因會產(chǎn)生大量無用或錯(cuò)誤的信息，干擾結(jié)果分析;RNA-Seq能夠檢測樣品中的所有RNA，而細(xì)胞中很大一部分RNA都來自核糖體和線粒體，限制了其他RNA的讀取數(shù)量以及這些RNA表達(dá)水平的準(zhǔn)確性。同時(shí)這兩種方法，科研花費(fèi)高，并且只能在專業(yè)實(shí)驗(yàn)中心完成。不具備在普通實(shí)驗(yàn)室完成的條件。定量PCR只能檢測單個(gè)或幾個(gè)基因的表達(dá)，無法大規(guī)模檢測基因。因此，研究者需要一種便捷迅速、能夠?qū)δ骋惶囟ㄉ飳W(xué)通路或疾病中相關(guān)基因進(jìn)行

3、針對性分析的定量工具，qPCRarray技術(shù)由此誕生。
　　qPCRarray方案中最關(guān)鍵的步驟是引物固化。引物固化后即可長期保存使用，為大規(guī)模樣本的研究帶來了便利。本實(shí)驗(yàn)通過將引物加熱烘干，使其固定在PCR管底。并與未固定的引物作為對照組，在相同的條件下，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。發(fā)現(xiàn)使用這兩種不同方法處理引物時(shí)，相同樣本中基因的表達(dá)量幾乎一致。
　　同時(shí)，本文還通過擴(kuò)增效率、重復(fù)性以及特異性等方面對qPCRarray檢測方

4、案進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)qPCRarray具有以下特點(diǎn):擴(kuò)增效率高、使其可以采用相對定量分析，比較基因間的差異;重復(fù)性好，CT值的平均差異只有0.2個(gè)循環(huán)，可檢測超過2倍的基因表達(dá)量變化。因此，PCRarray是可以用來研究特定生物學(xué)通路或疾病中相關(guān)基因表達(dá)量的變化。
　　本研究選擇了88個(gè)膽固醇代謝基因和4個(gè)看家基因，同時(shí)設(shè)置了基因組污染質(zhì)控以及陰性對照，建立了穩(wěn)定可靠的qPCRarray檢測方案。利用該方案檢測高糖誘導(dǎo)下肝癌細(xì)胞中膽固