犬細(xì)胞免疫因子RT-qPCR檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用.pdf

1、實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光探針或者熒光染料，利用熒光信號(hào)的積累，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR的反應(yīng)進(jìn)程，通過(guò)制作出的標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)未知模版進(jìn)行定量分析。因其具有操作簡(jiǎn)便、快速高效、高敏感性等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于分子診斷、分子生物研究、動(dòng)物及食品安全檢測(cè)等方面。
　　本實(shí)驗(yàn)分離了犬全血中的外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)PCR成功擴(kuò)增出IL-4、IL-10、IL-13、IFN-α等幾種細(xì)胞免疫因子的基因片段，連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)

2、化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，在Amp抗性培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選、PCR和測(cè)序等驗(yàn)證，構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒。最后成功建立了檢測(cè)犬全血中IL-4、1L-10、IL-13、IFN-α等細(xì)胞因子的實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法，該方法的模版在102～108拷貝/μL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2均達(dá)到0.992以上。利用該方法對(duì)犬瘟熱病毒(CDV)、犬細(xì)小病毒(CPV)、犬腺病毒Ⅰ型(CAV-1)三聯(lián)活疫苗免疫比格犬后的細(xì)胞免疫水平進(jìn)行了評(píng)價(jià)。