塵螨特異性免疫治療減輕哮喘小鼠氧化應(yīng)激及氣道上皮細胞凋亡的機制研究.pdf

1、目的:目前很多實驗研究表明氧化應(yīng)激以及細胞凋亡在哮喘發(fā)病的過程中起著重要的作用，而特異性免疫治療(Special ImmunologicTherapy, SIT)是治療哮喘的唯一根治性治療方法，因此本實驗旨在探討塵螨特異性治療在減輕哮喘氣道細胞凋亡以及氣道氧化應(yīng)激中的作用以及其機制的研究。
　　方法:本實驗分為動物部分和細胞部分。動物實驗:將32只6-8周齡Balb/C小鼠隨機分為正常對照組、哮喘模型組、SIT組、N-乙酰半胱氨酸

2、(N-acetylcysteine，NAC)組。哮喘組、SIT組、NAC組用塵螨粗提液進行致敏，SIT組和NAC組在小鼠滴鼻激發(fā)之前進行治療干預。對照組的操作給予PBS處理。激發(fā)后24h內(nèi)進行氣道高反應(yīng)性檢測，之后將小鼠處死并采集標本。行肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)中ROS(Reative Oxygen Species)以及細胞因子的檢測，肺組織HE染色(Hematoxylin-eos

3、in staining),PAS染色(Periodic Acid-Schiff, PAS),TUNEL凋亡實驗。肺組織冰凍切片檢測活性氧ROS，肺組織勻漿檢測細胞因子以及MDA，流式細胞術(shù)(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測Treg細胞(RegulatoryT Cells)。細胞實驗:分為對照組，IL-25低濃度組， IL-25高濃度組，將重組人IL-25加入細胞培養(yǎng)皿中刺激細胞，分別在12h和24h收集細胞行細胞凋亡實驗Ann

4、exin V-PI(AV-PI)以及流式檢測ROS實驗。
　　結(jié)果:1.動物實驗:(1)氣道高反應(yīng)性的檢測:哮喘模型組中的小鼠氣道反應(yīng)性較于正常組小鼠有明顯的增高，而SIT組和NAC組小鼠氣道反應(yīng)性較哮喘組中小鼠有所減輕。(2)肺泡灌洗液炎癥細胞計數(shù):SIT組和NAC組炎癥細胞總數(shù)以及少于哮喘組，其中嗜酸性粒細胞比例小于哮喘組。(3) HE染色:SIT組和NAC組小鼠肺組織中炎性細胞浸潤較哮喘組小鼠有明顯減輕。(4)PAS染色:S

5、IT組和NAC組小鼠氣道粘液分泌較哮喘小鼠有所減輕。(5)TUNEL染色:SIT組和NAC組小鼠肺組織以及氣道細胞凋亡細胞明顯較哮喘組小鼠有所減少。(6) sIgG1，sIgE以及細胞因子ELISA:塵螨特異性免疫治療則明顯降低了sIgG1，sIgE，IL-4，IL-5，IL-13，IL-25的含量。(7) MDA(丙二醛)檢測:哮喘小鼠肺組織MDA含量明顯升高，而塵螨特異性免疫治療和NAC組明顯降低肺組織中脂質(zhì)氧化產(chǎn)物MDA的含量。(

6、8)肺泡灌洗液ROS檢測:哮喘組小鼠肺泡灌洗液細胞中ROS明顯增多，而SIT組以及NAC組明顯減少了BALF中的ROS生成(9)流式檢測Treg細胞:SIT治療的哮喘小鼠Treg細胞數(shù)量相較于正常PBS組和哮喘模型組小鼠有顯著的增多。第二部分:細胞實驗:(1) Annexin V-PI(AV-PI)凋亡細胞檢測:IL-25可以明顯上調(diào)16HBE人氣道上皮細胞的凋亡。(2)流式檢測ROS:IL-25能夠刺激16HBE人氣道上皮細胞ROS的

7、生成。
　　結(jié)論:第一部分動物實驗:1塵螨特異性免疫治療可以減輕哮喘小鼠氣道高反應(yīng)哮喘癥狀，降低sIgE水平，并可能通過下調(diào)Treg細胞減輕哮喘小鼠肺組織的炎癥浸潤。2.塵螨特異性免疫治療可以下調(diào)一系列炎性細胞因子的表達，可以下調(diào)IL-25的表達。3.塵螨特異性免疫治療可以減輕哮喘小鼠肺組織氧化應(yīng)激以及肺組織細胞的凋亡。第二部分:細胞實驗:1.IL-25細胞因子可以誘發(fā)HBE細胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。2.IL-25細胞因子可以誘導16H