依達(dá)拉奉通過(guò)抗氧化機(jī)制對(duì)哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景
　　 支氣管哮喘是全球常見(jiàn)的慢性疾病之一，近幾十年來(lái)哮喘的發(fā)病率病死率在全世界內(nèi)持續(xù)增長(zhǎng)。隨著全球范圍內(nèi)空氣污染的日益加劇、工業(yè)化的發(fā)展，支氣管哮喘的反復(fù)發(fā)作已經(jīng)受到醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。慢性哮喘患者病理表現(xiàn)為氣道上皮細(xì)胞的破壞脫落，哮喘患者氣道黏膜表面上皮細(xì)胞的脫落和損害比其他氣道炎癥性病變更為嚴(yán)重。細(xì)胞凋亡可能是上皮細(xì)胞損傷的一個(gè)機(jī)制，從而引起哮喘的反復(fù)發(fā)作，聚集到氣道的炎癥細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基促進(jìn)了上皮細(xì)胞的凋亡，在哮喘

2、的發(fā)病機(jī)制中起一定的作用。而過(guò)去傳統(tǒng)的最經(jīng)典治療哮喘方案是應(yīng)用糖皮質(zhì)激素，應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可以迅速緩解哮喘癥狀，但是不能有效預(yù)防哮喘的反復(fù)發(fā)作及減輕氣道的損傷，而且長(zhǎng)期大量的應(yīng)用糖皮質(zhì)激素會(huì)導(dǎo)致許多嚴(yán)重不良反應(yīng)。鑒于傳統(tǒng)治療支氣管哮喘的許多不足之處，探索新的有效治療哮喘靶點(diǎn)及新型藥物就顯的尤為重要。
　　 研究目的
　　 氧自由基清除劑可否通過(guò)抗氧化機(jī)制抑制上皮細(xì)胞的凋亡尚無(wú)報(bào)到。觀察依達(dá)拉奉對(duì)氣道上皮細(xì)胞調(diào)亡及bcl-2

3、mRNA、FADD的影響，探討依達(dá)拉奉通過(guò)抗氧化機(jī)制減輕哮喘豚鼠氣道上皮細(xì)胞的凋亡，為防治哮喘反復(fù)發(fā)作應(yīng)用自由基清除劑提供理論依據(jù)并藉此希望尋找到新的哮喘藥物治療靶點(diǎn)。
　　 材料方法
　　 40只健康豚鼠隨機(jī)分成4組：正常對(duì)照組(A)、哮喘模型組(B)、地塞米松干預(yù)組(C)、依達(dá)拉奉干預(yù)組(D)，每組10只。用新鮮配制的OVA、AL(OH)3混懸液按照每只0.2ml的劑量(含OVA100ug、AL(OH)32.25mg

4、)在第1天、第14天以皮下、腹腔多點(diǎn)注射的方式致敏豚鼠，于第24-30天，連續(xù)7天每天把豚鼠置于密閉玻璃箱(30cm×40cm×20cm)中用霧化吸入器霧化吸入2％OVA液30分鐘激發(fā)豚鼠哮喘，制作豚鼠哮喘模型。依達(dá)拉奉干預(yù)組、地塞米松干預(yù)組豚鼠哮喘制作與哮喘組制作相同，但在每次霧化吸入激發(fā)之前半小時(shí)給予腹腔注射依達(dá)拉奉注射液(3mg/kg)、地塞米松磷酸鈉注射液(2mg/kg)。正常對(duì)照組豚鼠制作過(guò)程與哮喘組相同，只是致敏液與霧化吸入

5、的激發(fā)液用生理鹽水代替。最后一次激發(fā)過(guò)24小時(shí)后將豚鼠殺死，進(jìn)行肺泡灌洗及灌洗液離心，再進(jìn)行肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù)，采用ELISA法檢測(cè)肺泡灌洗液中的IL-5含量、肺組織HE染色行病理學(xué)檢查、3’末端脫氧核苷轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧三磷酸尿苷(d-UTP)缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法檢測(cè)上皮細(xì)胞凋亡、免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)FADD、MDA與SOD用相應(yīng)試劑盒檢測(cè)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)半定量(RT-PCR)法檢測(cè)肺組織中bcl-2mRNA的表達(dá)水

6、平。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 1各組豚鼠的癥狀比較：哮喘組豚鼠OVA激發(fā)后出現(xiàn)了典型哮喘癥狀；地塞米松組豚鼠較哮喘組豚鼠明顯減輕；依達(dá)拉奉干預(yù)組豚鼠哮喘癥狀也有改善；正常對(duì)照組豚鼠未見(jiàn)異常癥狀。
　　 2各組豚鼠肺組織病理：肺組織HE染色結(jié)果顯示哮喘組豚鼠肺組織有比較多的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，結(jié)構(gòu)破壞明顯，上皮細(xì)胞脫落明顯；依達(dá)拉奉干預(yù)組與地塞米松組均比哮喘組減輕；正常對(duì)照

7、組豚鼠正常。
　　 3各組豚鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)及分類：哮喘組、依達(dá)拉奉干預(yù)組、地塞米松干預(yù)組及正常組豚鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)分別是(10.0±1.0)×106、(3.8±0.5)×106、(4.6±0.6)×106、(1.9±0.4)×106;BALF中嗜酸性粒細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比例分別為(35.6±3.7)％、(8.0±0.8)％、(9.8±1.0)％、(0.7±0.1)％;BALF中淋巴細(xì)胞占細(xì)胞總數(shù)比例分別為(15.4±3.3

8、)％、(5.7±0.5)％、(7.3±0.7)％、(3.2±0.6)％。
　　 4各組豚鼠BALF中IL-5的濃度：哮喘組、依達(dá)拉奉干預(yù)組、地塞米松干預(yù)組及正常對(duì)照組豚鼠BALF中IL-5水平分別為(52.44±12.84)pg/ml、(17.84±4.25)pg/ml、(21.74±5.19)pg/ml、(5.68±1.35)pg/ml。
　　 5各組豚鼠肺組織中氣道上皮細(xì)胞凋亡情況：哮喘模型組中氣道上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)為

9、(35.26±4.36)％；依達(dá)拉奉干預(yù)組凋亡指數(shù)為(15.69±3.12)％；地塞米松干預(yù)組凋亡指數(shù)為(16.23±4.17)％；正常對(duì)照組中凋亡指數(shù)為(2.12±0.85)％。
　　 6各組豚鼠肺組織中MDA、SOD的含量：哮喘模型組中MDA的含量明顯高于依達(dá)拉奉干預(yù)組及地塞米松干預(yù)組，依達(dá)拉奉干預(yù)組與地塞米松干預(yù)組之間無(wú)明顯差異。正常對(duì)照組水平較低。SOD的含量趨勢(shì)與之相反。
　　 7各組豚鼠肺組織中氣道上皮FAD

10、D的表達(dá)：用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)FADD的表達(dá)，胞漿呈棕黃色的即為FADD陽(yáng)性細(xì)胞，在光鏡下觀察免疫組化染色制片，觀察10個(gè)完整的小支氣管管壁并計(jì)算胞漿染色陽(yáng)性細(xì)胞占上皮細(xì)胞的百分比，取其平均值即代表FADD的表達(dá)水平，哮喘模型組中FADD的表達(dá)明顯增加。
　　 8各組豚鼠肺組織bcl-2mRNA表達(dá)：RT-PCR檢測(cè)bcl-2mRNA表達(dá)結(jié)果示：哮喘組(0.194±0.023)；依達(dá)拉奉干預(yù)組(0.426±0.043)；地塞

11、米松干預(yù)組(0.577±0.056);正常對(duì)照組(0.367±0.038)。依達(dá)拉奉干預(yù)組的表達(dá)高于哮喘組。
　　 9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：BALF中IL-5水平、細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞數(shù)量均是哮喘組＞依達(dá)拉奉干預(yù)組＞正常對(duì)照組(差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05)，依達(dá)拉奉干預(yù)組與地塞米松干預(yù)組無(wú)差異。與此同時(shí)bcl-2mRNA的表達(dá)水平是正常對(duì)照組＞依達(dá)拉奉干預(yù)組＞哮喘組(差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P＜0.05)，依達(dá)拉奉干預(yù)組與地