依達拉奉通過抗氧化機制對哮喘豚鼠氣道上皮細胞凋亡的影響.pdf

1、研究背景
　　 支氣管哮喘是全球常見的慢性疾病之一，近幾十年來哮喘的發(fā)病率病死率在全世界內持續(xù)增長。隨著全球范圍內空氣污染的日益加劇、工業(yè)化的發(fā)展，支氣管哮喘的反復發(fā)作已經受到醫(yī)學界的廣泛關注。慢性哮喘患者病理表現(xiàn)為氣道上皮細胞的破壞脫落，哮喘患者氣道黏膜表面上皮細胞的脫落和損害比其他氣道炎癥性病變更為嚴重。細胞凋亡可能是上皮細胞損傷的一個機制，從而引起哮喘的反復發(fā)作，聚集到氣道的炎癥細胞產生氧自由基促進了上皮細胞的凋亡，在哮喘

2、的發(fā)病機制中起一定的作用。而過去傳統(tǒng)的最經典治療哮喘方案是應用糖皮質激素，應用糖皮質激素可以迅速緩解哮喘癥狀，但是不能有效預防哮喘的反復發(fā)作及減輕氣道的損傷，而且長期大量的應用糖皮質激素會導致許多嚴重不良反應。鑒于傳統(tǒng)治療支氣管哮喘的許多不足之處，探索新的有效治療哮喘靶點及新型藥物就顯的尤為重要。
　　 研究目的
　　 氧自由基清除劑可否通過抗氧化機制抑制上皮細胞的凋亡尚無報到。觀察依達拉奉對氣道上皮細胞調亡及bcl-2

3、mRNA、FADD的影響，探討依達拉奉通過抗氧化機制減輕哮喘豚鼠氣道上皮細胞的凋亡，為防治哮喘反復發(fā)作應用自由基清除劑提供理論依據并藉此希望尋找到新的哮喘藥物治療靶點。
　　 材料方法
　　 40只健康豚鼠隨機分成4組：正常對照組(A)、哮喘模型組(B)、地塞米松干預組(C)、依達拉奉干預組(D)，每組10只。用新鮮配制的OVA、AL(OH)3混懸液按照每只0.2ml的劑量(含OVA100ug、AL(OH)32.25mg

4、)在第1天、第14天以皮下、腹腔多點注射的方式致敏豚鼠，于第24-30天，連續(xù)7天每天把豚鼠置于密閉玻璃箱(30cm×40cm×20cm)中用霧化吸入器霧化吸入2％OVA液30分鐘激發(fā)豚鼠哮喘，制作豚鼠哮喘模型。依達拉奉干預組、地塞米松干預組豚鼠哮喘制作與哮喘組制作相同，但在每次霧化吸入激發(fā)之前半小時給予腹腔注射依達拉奉注射液(3mg/kg)、地塞米松磷酸鈉注射液(2mg/kg)。正常對照組豚鼠制作過程與哮喘組相同，只是致敏液與霧化吸入

5、的激發(fā)液用生理鹽水代替。最后一次激發(fā)過24小時后將豚鼠殺死，進行肺泡灌洗及灌洗液離心，再進行肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)，采用ELISA法檢測肺泡灌洗液中的IL-5含量、肺組織HE染色行病理學檢查、3’末端脫氧核苷轉移酶介導的脫氧三磷酸尿苷(d-UTP)缺口末端標記(TUNEL)法檢測上皮細胞凋亡、免疫組織化學染色法檢測FADD、MDA與SOD用相應試劑盒檢測、逆轉錄-聚合酶鏈反應半定量(RT-PCR)法檢測肺組織中bcl-2mRNA的表達水

6、平。所有實驗數(shù)據應用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。
　　 實驗結果
　　 1各組豚鼠的癥狀比較：哮喘組豚鼠OVA激發(fā)后出現(xiàn)了典型哮喘癥狀；地塞米松組豚鼠較哮喘組豚鼠明顯減輕；依達拉奉干預組豚鼠哮喘癥狀也有改善；正常對照組豚鼠未見異常癥狀。
　　 2各組豚鼠肺組織病理：肺組織HE染色結果顯示哮喘組豚鼠肺組織有比較多的炎性細胞浸潤，結構破壞明顯，上皮細胞脫落明顯；依達拉奉干預組與地塞米松組均比哮喘組減輕；正常對照

7、組豚鼠正常。
　　 3各組豚鼠BALF中細胞總數(shù)及分類：哮喘組、依達拉奉干預組、地塞米松干預組及正常組豚鼠BALF中細胞總數(shù)分別是(10.0±1.0)×106、(3.8±0.5)×106、(4.6±0.6)×106、(1.9±0.4)×106;BALF中嗜酸性粒細胞占細胞總數(shù)比例分別為(35.6±3.7)％、(8.0±0.8)％、(9.8±1.0)％、(0.7±0.1)％;BALF中淋巴細胞占細胞總數(shù)比例分別為(15.4±3.3

8、)％、(5.7±0.5)％、(7.3±0.7)％、(3.2±0.6)％。
　　 4各組豚鼠BALF中IL-5的濃度：哮喘組、依達拉奉干預組、地塞米松干預組及正常對照組豚鼠BALF中IL-5水平分別為(52.44±12.84)pg/ml、(17.84±4.25)pg/ml、(21.74±5.19)pg/ml、(5.68±1.35)pg/ml。
　　 5各組豚鼠肺組織中氣道上皮細胞凋亡情況：哮喘模型組中氣道上皮細胞凋亡指數(shù)為

9、(35.26±4.36)％；依達拉奉干預組凋亡指數(shù)為(15.69±3.12)％；地塞米松干預組凋亡指數(shù)為(16.23±4.17)％；正常對照組中凋亡指數(shù)為(2.12±0.85)％。
　　 6各組豚鼠肺組織中MDA、SOD的含量：哮喘模型組中MDA的含量明顯高于依達拉奉干預組及地塞米松干預組，依達拉奉干預組與地塞米松干預組之間無明顯差異。正常對照組水平較低。SOD的含量趨勢與之相反。
　　 7各組豚鼠肺組織中氣道上皮FAD

10、D的表達：用免疫組織化學染色法檢測FADD的表達，胞漿呈棕黃色的即為FADD陽性細胞，在光鏡下觀察免疫組化染色制片，觀察10個完整的小支氣管管壁并計算胞漿染色陽性細胞占上皮細胞的百分比，取其平均值即代表FADD的表達水平，哮喘模型組中FADD的表達明顯增加。
　　 8各組豚鼠肺組織bcl-2mRNA表達：RT-PCR檢測bcl-2mRNA表達結果示：哮喘組(0.194±0.023)；依達拉奉干預組(0.426±0.043)；地塞

11、米松干預組(0.577±0.056);正常對照組(0.367±0.038)。依達拉奉干預組的表達高于哮喘組。
　　 9統(tǒng)計學分析：BALF中IL-5水平、細胞總數(shù)、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞數(shù)量均是哮喘組＞依達拉奉干預組＞正常對照組(差異均具有統(tǒng)計學意義P＜0.05)，依達拉奉干預組與地塞米松干預組無差異。與此同時bcl-2mRNA的表達水平是正常對照組＞依達拉奉干預組＞哮喘組(差異均具有統(tǒng)計學意義P＜0.05)，依達拉奉干預組與地