氧化應(yīng)激下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞凋亡和JNK的調(diào)控機(jī)制.pdf

1、第一部分 原代大鼠肺泡II型上皮細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)及鑒定背景肺泡上皮易受各種應(yīng)激的損傷，它的損傷后修復(fù)主要依賴于肺泡上皮的干細(xì)胞——肺泡II型上皮細(xì)胞(alveolar type II epithelial cells，ATII cells)。ATII細(xì)胞體積較小、呈立方形，占肺泡上皮細(xì)胞數(shù)的60％左右，能通過(guò)增殖、鋪展、遷移，并最終轉(zhuǎn)化為肺泡I型上皮細(xì)胞(alveolartype I epithelial cells，ATI

2、 cells)，恢復(fù)肺泡上皮正常的形態(tài)和功能。另外，ATII細(xì)胞還具有很多重要功能：合成、分泌和重新利用表面活性物質(zhì)；轉(zhuǎn)運(yùn)離子和水分；合成免疫效應(yīng)分子。但ATII細(xì)胞的原代分離、純化技術(shù)較為復(fù)雜，本研究的目的是掌握成年大鼠ATII細(xì)胞的分離、純化和培養(yǎng)技術(shù)，以獲得數(shù)量足夠、純度高的ATII細(xì)胞，滿足下一步實(shí)驗(yàn)的需要。 目的： 確定成年大鼠原代ATII細(xì)胞分離、純化、培養(yǎng)的技術(shù)方法，為研究氧化應(yīng)激下ATII細(xì)胞存活、凋亡和

3、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制提供數(shù)量足夠和高純度的ATII細(xì)胞，以滿足實(shí)驗(yàn)的需要。 方法： 水合氯醛麻醉清潔級(jí)Spraque-Dawley大鼠(約200g)，打開胸腔行肺動(dòng)脈插管，以生理鹽水沖凈肺血。整體取出心肺和氣管，氣管插管，以緩沖液灌洗肺泡腔10次。將0.08％胰蛋白酶消化液從氣管注入肺泡，置于37℃，5％二氧化碳(carbon dioxide，CO2)培養(yǎng)箱，每隔5分鐘添加適量消化液，20分鐘后，去除氣管及肺門周圍結(jié)締組織置于2

4、.50μg/ml脫氧核糖核酸酶I(deoxyribonuclease I，Dnase I)和終止血清混合液中，快速剪肺至1mm3小塊，篩網(wǎng)過(guò)濾，離心收集細(xì)胞，DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至大鼠IgG包被的培養(yǎng)皿中，吸附純化2h，用含10％胎牛血清、10u/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于6孔培養(yǎng)板或96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞接種后24h換液，繼續(xù)培養(yǎng)12h備用。臺(tái)盼藍(lán)拒染法測(cè)定細(xì)胞活力。透射電鏡

5、(Transmitting electron microscopy,FEM)鑒定細(xì)胞，改良巴式染色法確定細(xì)胞純度。在體外培養(yǎng)細(xì)胞不同的時(shí)間(36、72、96和120h)觀察細(xì)胞的性狀和形態(tài)變化。 結(jié)論： 利用0.08％胰酶消化分離和大鼠Ig免疫粘附純化，可獲得高產(chǎn)量、高純度、高活力的原代AT Ⅱ細(xì)胞，能滿足實(shí)驗(yàn)的需要。AtⅡ細(xì)胞體外培養(yǎng)36至72h時(shí)生長(zhǎng)良好，可進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)。 第二部分 氧化應(yīng)激誘導(dǎo)肺泡Ⅱ

6、型上皮細(xì)胞的損傷作用及JNK調(diào)控作用背景氧氣療法是臨床上治療急性呼吸衰竭常用且有效的措施，但長(zhǎng)時(shí)間高氧暴露可引起氧化應(yīng)激性肺損傷。高濃度氧氣(氧氣體積分?jǐn)?shù)＞0.95，簡(jiǎn)稱高氧)暴露下產(chǎn)生的活性氧(reactive oxygen species，ROS)是導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷的主要致病因素。ROS可造成細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化損傷，蛋白質(zhì)的應(yīng)激性修飾，基因的畸變等細(xì)胞損傷，導(dǎo)致細(xì)胞完整性和功能的破壞。更為重要的是ROS還可通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)

7、系統(tǒng)而參與細(xì)胞的凋亡。包括c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)在內(nèi)的絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinases，MAPKs)家族信號(hào)通路是多種刺激通過(guò)細(xì)胞膜到達(dá)細(xì)胞核的共同通道。MAPKs主要由JNK、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(Extracellular signal-regulated kinase，ERK)和p38三條信號(hào)通路組成，其中JNK信號(hào)通路是

8、一條主要的應(yīng)激信號(hào)通路，在調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、凋亡和免疫反應(yīng)等方面具有重要作用，但JNK信號(hào)的作用因細(xì)胞種類、刺激類型而有所差異。氧化應(yīng)激下AtⅡ細(xì)胞的凋亡(在肺損傷和纖維化中具有重要作用)可能涉及JNK信號(hào)，但JNK信號(hào)在其中起的作用尚不清除。 目的： 1.采用過(guò)氧化氫(Hydrogen peroxide，H2O2)和無(wú)血清培養(yǎng)基建立原代大鼠AtⅡ細(xì)胞的氧化損傷模型。 2.研究H2O2對(duì)AtⅡ細(xì)胞形態(tài)、存活和凋亡的

9、影響，探討細(xì)胞損傷與H2O2作用的濃度和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。 3.了解氧化應(yīng)激下AtⅡ細(xì)胞凋亡過(guò)程中JNK的活化情況，并采用JNK信號(hào)抑制劑預(yù)先干預(yù)，觀察其是否能有效抑制H2O2誘導(dǎo)的JNK的活化，從而研究JNK對(duì)細(xì)胞凋亡的作用。 方法： 分離、純化清潔級(jí)Spraque-Dawley成年大鼠的AtⅡ細(xì)胞，臺(tái)盼蘭拒染法鑒定細(xì)胞活性，改良巴氏染色法鑒定細(xì)胞純度。AtⅡ細(xì)胞用不同濃度的H2O2(0μM、50μM、100μM、

10、500μM和1000μM)處理3h；以500μMH2O2處理不同時(shí)間(0h、1h、3h、6h和9h)；采用倒置相差顯微鏡細(xì)胞形態(tài)變化，MTT比色法測(cè)定細(xì)胞存活率，流式細(xì)胞術(shù)定量檢測(cè)凋亡率，以明確細(xì)胞損傷與H2O2作用的濃度和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。500μM H2O2作用細(xì)胞3h后，透射電鏡觀察細(xì)胞凋亡改變。Western blot檢測(cè)500μM H2O2刺激ATII細(xì)胞(0、5、10、30、60、180、360和540min)后p-JNK的表達(dá)

11、。在研究JNK信號(hào)作用時(shí)，細(xì)胞隨機(jī)分為4組：以無(wú)血清培養(yǎng)基作用細(xì)胞3h，設(shè)為對(duì)照組(CON組)；25μMSP600125(JNK信號(hào)特異性抑制劑)預(yù)處理，再以無(wú)血清培養(yǎng)基作用細(xì)胞3h，設(shè)為CON+SP組；以500μM H2O2作用細(xì)胞3h，設(shè)為H2O2組；細(xì)胞預(yù)先加入25μM SP600125(JNK信號(hào)特異性抑制劑)，再以500μM H2O2刺激3h，設(shè)為H2O2+SP組，檢測(cè)細(xì)胞的存活率和凋亡率；熒光顯微鏡觀察熒光染料4，6一二咪基

12、一--聯(lián)苯基吲哚(4'，6-Diamidino-2-phenylindole，DAPI)染色后細(xì)胞核的形態(tài)變化。 結(jié)論： 1.H2O2以濃度和時(shí)間依賴的方式誘導(dǎo)AT Ⅱ細(xì)胞損傷。 2.通過(guò)流式細(xì)胞儀和電鏡證實(shí)：H2O2刺激可誘導(dǎo)AT Ⅱ細(xì)胞發(fā)生凋亡。 3.JNK參與了氧化應(yīng)激下ATII細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并對(duì)AT Ⅱ細(xì)胞起促凋亡的作用。 第三部分 JNK對(duì)AT Ⅱ細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白及核轉(zhuǎn)錄因

13、子表達(dá)或活化的調(diào)控作用背景目前廣泛認(rèn)為在高氧暴露過(guò)程中產(chǎn)生的ROS是導(dǎo)致氧化應(yīng)激性肺損傷的主要致病因素，ROS刺激可引起肺組織細(xì)胞的凋亡。近年來(lái)，ROS對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用逐漸引起人們的重視。ATII細(xì)胞對(duì)維持正常呼吸功能和肺泡上皮完整有十分重要的作用，如果它過(guò)度凋亡，肺損傷和組織纖維化將不可避免。越來(lái)越多的研究者關(guān)注ATII細(xì)胞的凋亡，但是氧化應(yīng)激下ATII細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。第二部分證實(shí)了JNK信號(hào)通路參與了氧化應(yīng)激下ATII細(xì)

14、胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)并對(duì)ATII細(xì)胞起促凋亡的作用，但JNK究竟通過(guò)哪些途徑達(dá)到促細(xì)胞凋亡的作用目前知之甚少。本部分進(jìn)一步研究ROS對(duì)肺泡上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響，并探索JNK信號(hào)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 目的： 1.觀察ROS對(duì)ATII細(xì)胞線粒體膜電位(Mitochondrial transmembranepotential，MMP)的損傷作用。 2.研究ROS對(duì)肺泡上皮細(xì)胞凋

15、亡相關(guān)蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 3.使用JNK信號(hào)抑制劑SP600125，探索JNK信號(hào)對(duì)氧化應(yīng)激下ATII細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)和核轉(zhuǎn)錄因子活化的影響。 結(jié)論： 1.H2O2刺激能破壞AtⅡ細(xì)胞線粒體膜電位，隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，線粒體膜電位明顯下降。 2.H2O2刺激能通過(guò)JNK信號(hào)通路，明顯上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白(Bax、p53、active caspase-3)和轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)的表達(dá)與活化，

16、從而起到促細(xì)胞凋亡作用。 第四部分 NAC對(duì)氧化應(yīng)激狀態(tài)下肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞的調(diào)控作用背景既然氧化應(yīng)激下ROS對(duì)細(xì)胞的死亡起著關(guān)鍵作用，我們認(rèn)為抗氧化處理可能有助于抑制氧化應(yīng)激下AtⅡ細(xì)胞的凋亡。N-乙酰半胱氨酸(N-Acetylcysteine，NAC)可作為還原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione，GSH)合成的前體，在氧化應(yīng)激下多種細(xì)胞的研究中已顯示出其具有良好的抗氧化特性。但目前尚不清楚NAC處理能否

17、對(duì)氧化應(yīng)激下AtⅡ細(xì)胞起到保護(hù)作用。本研究探討NAC對(duì)氧化應(yīng)激下MAPKs激活的影響和AtⅡ細(xì)胞的保護(hù)作用。 目的： 1.研究NAC預(yù)處理能否對(duì)氧化應(yīng)激下的AtⅡ細(xì)胞起保護(hù)作用。 2.研究NAC預(yù)處理對(duì)H2O2刺激后AtⅡ細(xì)胞內(nèi)ROS水平及MAPKs激活的影響。方法原代培養(yǎng)的大鼠ATII細(xì)胞，隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(CON組)、CON+NAC組、H2O2組和H2O2+NAC組。MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率的變化，