嘧啶核苷產(chǎn)生菌的構(gòu)建及發(fā)酵優(yōu)化.pdf

1、嘧啶核苷包括尿苷和胞苷，它們是RNA的組成成分，在一切生物體的生命活動(dòng)及代謝過程中均占有重要地位。近年來，它們被用作生產(chǎn)抗病毒抗腫瘤藥物的中間體，如碘苷(IDUR)、溴苷(BUDR)、氟苷(FUDR)，三磷酸胞苷(CTP)、阿糖胞苷(Ara-CR)、環(huán)胞苷(Cyclo C)、胞二磷膽堿(CDP-Choline)等，發(fā)揮出重大的醫(yī)藥價(jià)值。利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)嘧啶核苷具有諸多優(yōu)勢(shì)，但國(guó)內(nèi)尚無應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的高產(chǎn)菌株。本文基于代謝工程理論對(duì)

2、菌種的選育進(jìn)行了研究，并采用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，最終使菌株嘧啶核苷積累量得以大幅提升，為工業(yè)化生產(chǎn)提供了借鑒和指導(dǎo)。
　　以野生型枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)168菌株為出發(fā)菌株，通過PCR技術(shù)擴(kuò)增其基因組上胞苷脫氨酶編碼基因cdd的上下游各約500 bp的同源臂，通過重疊PCR拼接后，與載體pKS1連接，構(gòu)建出重組質(zhì)粒pKS1Δcdd。將該質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化入168菌株，利用質(zhì)粒的溫敏特性，通過同源重

3、組敲除了cdd基因，阻斷了胞苷向下代謝為尿苷的代謝流，構(gòu)建出菌株Bacillus subtilis PYR1。該菌株具備積累兩種嘧啶核苷的可能，為下一步菌種選育打下了基礎(chǔ)。
　　通過與天津大學(xué)化工學(xué)院代謝工程室合作，以菌株P(guān)YR1為受體菌株，構(gòu)建了一系列的基因工程菌株。利用搖瓶發(fā)酵對(duì)這些菌株進(jìn)行產(chǎn)苷性能測(cè)試，并考察每個(gè)關(guān)鍵基因的改造對(duì)菌株產(chǎn)苷的影響。結(jié)果主要如下: hom基因和pyrR基因的敲除使菌株對(duì)于嘧啶核苷的積累從無到有，但

4、有較多副產(chǎn)物尿嘧啶的積累;pdp基因和nupC基因的敲除進(jìn)一步提高了嘧啶核苷的積累量，尿苷產(chǎn)量提高了1.43倍，胞苷產(chǎn)量提高了0.27倍，且副產(chǎn)物尿嘧啶的積累量降低了46.9％;野生型和突變型prs基因的過表達(dá)均對(duì)菌株產(chǎn)嘧啶核苷具有正影響，雖然胞苷積累量提升幅度不大，但尿苷積累量分別提高了31.93％和74.79％，后者效果優(yōu)于前者，此外，副產(chǎn)物尿嘧啶積累量極少;pyrAB基因的定點(diǎn)突變?cè)龃罅肃奏ず铣赏?，尿苷產(chǎn)量提高了76.44％，胞

5、苷產(chǎn)量提高了16.22％。這些工作也明確了后續(xù)菌種選育的任務(wù)和方向。通過對(duì)發(fā)酵結(jié)果各項(xiàng)參數(shù)的比較，篩選出一株性能良好的菌株P(guān)YR5，以此為出發(fā)菌株，進(jìn)行下一步的工作。
　　以尿苷產(chǎn)量為響應(yīng)值，用響應(yīng)面法對(duì)菌株P(guān)YR5產(chǎn)嘧啶核苷的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。首先，通過PB實(shí)驗(yàn)確定了對(duì)產(chǎn)苷影響顯著的三個(gè)因素:酵母粉、豆粕水解液和谷氨酸鈉。然后，利用最陡爬坡實(shí)驗(yàn)逼近響應(yīng)面分析的最佳區(qū)域;最后，通過中心復(fù)合實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定了三個(gè)顯著因素的最