高產(chǎn)谷胱甘肽工程菌的構(gòu)建及代謝產(chǎn)物研究.pdf

1、還原型谷胱甘肽(GSH)是一種由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸組成三肽化合物，在生物體內(nèi)廣泛存在且具有清除自由基、抗氧化、解毒、抑制HIV等功能。因此 GSH被廣泛的應(yīng)用于臨床醫(yī)藥、食品加工、化妝品等行業(yè)。目前，工業(yè)上可以利用發(fā)酵或酶合成的方法生產(chǎn)GSH，由于我國(guó)還沒(méi)有實(shí)現(xiàn)GSH的大規(guī)模生產(chǎn)，其主要依賴于外國(guó)進(jìn)口。因此，實(shí)現(xiàn)我國(guó)GSH的工業(yè)化生產(chǎn)迫在眉睫。
　　微生物發(fā)酵法是生產(chǎn)GSH的最主要的方法。在大多數(shù)真核細(xì)胞和革蘭氏陰性

2、細(xì)菌中，谷胱甘肽的生物合成主要是通過(guò)兩步依賴于ATP的酶催化反應(yīng)。L-谷氨酸、L-半胱氨酸在γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（GSHⅠ）的作用下合成γ-谷氨酰半胱氨酸，然后在谷胱甘肽合酶(GSH Ⅱ）的作用下，與甘氨酸反應(yīng)生成谷胱甘肽。在谷胱甘肽的生產(chǎn)過(guò)程中，GSHⅠ受到GSH的反饋抑制。最近的一些研究表明，在一些致病性的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中存在一種雙功能酶—γ-谷氨酰半胱氨酸合酶-谷胱甘肽合酶（GshF），該酶可以單獨(dú)催化谷胱甘肽的生成，且對(duì)反饋抑

3、制不敏感。本文旨在于利用生物合成的方法獲得整合異源GshF基因的高產(chǎn)GSH酵母菌株，再通過(guò)培養(yǎng)條件的優(yōu)化，提高GSH的產(chǎn)量。具體研究?jī)?nèi)容如下：
　　（1）高產(chǎn)GSH釀酒酵母菌的構(gòu)建
　　將克隆的GshF基因分別與含有不同啟動(dòng)子（GAP-SCP、GAP-PC、PGK1、GAL1）的載體連接形成融合基因，獲得含有不同啟動(dòng)子的表達(dá)載體，將表達(dá)載體轉(zhuǎn)化釀酒酵母W303-1B。通過(guò) G418抗性篩選標(biāo)記篩選獲得陽(yáng)性克隆 w303B/G

4、shF-GAP-SCP、w303B/GshF-GAP-PC、w303B/GshF-PGK1、w303B/GshF-GAL1，然后利用ABD-F柱前衍生法進(jìn)行代謝產(chǎn)物GSH的分析。結(jié)果表明，通過(guò)搖瓶培養(yǎng)，w303B/GshF-GAP-SCP為高產(chǎn)GSH釀酒酵母工程菌。
　?。?）高產(chǎn)GSH釀酒酵母工程菌w303B/GshF-GAP-SCP的最適培養(yǎng)條件優(yōu)化
　　在搖瓶水平上通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)，考察培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)基中葡萄糖含量對(duì)GS

5、H產(chǎn)量的影響。得到最佳發(fā)酵條件：發(fā)酵溫度30℃，搖床轉(zhuǎn)速200rpm，接種量OD600=0.15，葡萄糖含量為20g/L，培養(yǎng)時(shí)間為3d。GSH產(chǎn)量可達(dá)到150 mg/L。
　?。?）氨基酸前體添加對(duì)工程菌生產(chǎn)GSH的影響
　　在搖瓶水平上考察三種前體氨基酸的添加對(duì)GSH產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，氨基酸前體的添加可以顯著提高工程菌胞內(nèi)GSH的產(chǎn)量，w303B/GshF-GAP-SCP合成GSH的最高產(chǎn)量可達(dá)250 mg/L。

6、r>　?。?）外泌蛋白（Adp）在高產(chǎn)谷胱甘肽釀酒酵母中的整合表達(dá)
　　本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了酵母自身的外泌蛋白基因Adp同源整合表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化酵母獲得工程菌株w303B/GshF-GAP-SCP/Adp，在搖瓶水平上考察Adp對(duì)工程菌GSH產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，Adp的整合能夠影響菌體生物量，但具有一定的外泌功能。
　?。?）工程菌w303B/GshF-GAP-SCP的10L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)
　　工程菌w303B/GshF-GA