運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌工程菌株的構(gòu)建及發(fā)酵的初步研究.pdf

1、20世紀(jì),科學(xué)家利用石油作為主要能源及石油化學(xué)品的原料,為人類社會(huì)發(fā)展做出了巨大的貢獻(xiàn)。但隨之也出現(xiàn)了兩個(gè)嚴(yán)重的問(wèn)題:一是石油為不可再生的資源。二是用石油作為燃料及化學(xué)品原料使環(huán)境遭到嚴(yán)重破壞,特別是CO2的溫室效應(yīng)。隨著人們對(duì)全球性能源危機(jī)認(rèn)識(shí)的不斷加深及環(huán)境保護(hù)意識(shí)的不斷加強(qiáng),研究與尋找環(huán)境友好的石油能源的替代品成為世界技術(shù)開(kāi)發(fā)的方向之一。從20世紀(jì)70年代中期開(kāi)始,利用生物技術(shù)和可再生資源(生物源)進(jìn)行乙醇的工業(yè)化生產(chǎn),并以此作為

2、石油能源的替代物成為各國(guó)的研究熱點(diǎn)。
　　 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌是極具開(kāi)發(fā)潛力的乙醇生產(chǎn)菌種,與傳統(tǒng)的發(fā)酵乙醇的微生物如釀酒酵母相比,運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌具有很多優(yōu)點(diǎn),但其可利用的底物僅為葡萄糖、果糖和蔗糖。為了開(kāi)發(fā)利用運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌卓越的產(chǎn)乙醇能力,應(yīng)用基因工程手段擴(kuò)大運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的底物范圍,使其能夠同時(shí)利用淀粉與纖維素生產(chǎn)乙醇,是實(shí)驗(yàn)的最終目的。
　　 本研究首先提取Z.mobilis ATCC31821總基因組DNA,進(jìn)行引

3、物設(shè)計(jì)(Jeong-Sun Seo et al.2005,GenBank Accession008692.2),從細(xì)菌中克隆出丙酮酸脫羧酶(pdc)啟動(dòng)子pdc。以酵母表達(dá)載體pPIC9K為模板,進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(Scorer,C.A..1994,GenBank:Z46234.1),用PCR的方法克隆出一段約為270bp的片段,即信號(hào)肽α-mating factor。提取瑞氏木霉總RNA,做RT-PCR,克隆出內(nèi)切葡聚糖酶基因。提取泡盛曲霉

4、總RNA,做RT-PCR,克隆出葡萄糖淀粉酶基因。
　　 將啟動(dòng)子pdc,信號(hào)肽,內(nèi)切葡聚糖酶基因和葡萄糖淀粉酶基因克隆到pBBR1-MCS2表達(dá)載體上,構(gòu)建了兩個(gè)單價(jià)載體pBPSG,pBPSE和一個(gè)雙價(jià)載體pBPSGE。將這三個(gè)表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)Z.mobilis ATCC31821,得到重組菌Z.mobilisATCC31821(pBPSG),Z.mobilis ATCC31821(pBPSE)和Z.mobilis ATCC31

5、821(pBPSGE)。30℃培養(yǎng),測(cè)其酶活分別為0.94U/ml、0.76U/ml、1.57U/ml,Z.mobilis、Zmobilis(pBBR1-MCS2)沒(méi)有檢測(cè)到酶活性。
　　 用Z.mobilis、Z.mobilis(pBBR1-MCS2)、Z.mobilis ATCC31821(pBPSG),Z.mobilis ATCC31821(pBPSE)和Z.mobilis ATCC31821(pBPSGE)發(fā)酵木薯粉。4

6、8h后運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的酒精產(chǎn)率達(dá)到最大值,Z.mobilis ATCC31821產(chǎn)量9.05°,Z.mobilis ATCC31821(pBBR1-MCS2)產(chǎn)量9.02°,Z.mobilis ATCC31821(pBPSG)產(chǎn)量9.34°,Z.mobilis ATCC31821(pBPSE)產(chǎn)量9.46°,Z.mobilis ATCC31821(pBPGE)產(chǎn)量9.71°。由結(jié)果可見(jiàn),重組菌酒精產(chǎn)量明顯比野生菌高。
　　 本研