基于代謝工程構(gòu)建大腸桿菌L-賴氨酸高產(chǎn)菌.pdf

1、L-賴氨酸（L-Lysine）對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用，由于不能通過(guò)轉(zhuǎn)氨作用合成，是人和動(dòng)物的必需氨基酸之一，被稱為第一限制性氨基酸，廣泛應(yīng)用于食品加工，醫(yī)藥制劑，飼料添加劑等方面。目前世界市場(chǎng)對(duì)L-賴氨酸的年需求總量約為160余萬(wàn)噸，年增長(zhǎng)率大約為7%-8%，因此提高L-賴氨酸的產(chǎn)量就顯得十分重要。目前L-賴氨酸主要采用直接發(fā)酵法生產(chǎn)，生產(chǎn)菌株主要是誘變育種得到的谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicu

2、m）突變菌株，存在生長(zhǎng)速度緩慢，糖耗速率低，對(duì)外界不良環(huán)境耐受力差等缺點(diǎn)。本論文利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌（Escherichia coli，簡(jiǎn)稱E.coli）工程菌株，采用發(fā)酵法進(jìn)行L-賴氨酸的生產(chǎn)，相比于背景尚不完全清楚的谷氨酸棒桿菌，基因操作較為簡(jiǎn)單，有利于菌種的進(jìn)一步改造；菌體生長(zhǎng)周期較短，培養(yǎng)方便，對(duì)生長(zhǎng)條件要求低的大腸桿菌，更適合工業(yè)化生產(chǎn)L-賴氨酸。
　　本論文首先構(gòu)建了過(guò)表達(dá)及異源表達(dá)L-賴氨酸生物合成途徑關(guān)鍵酶

3、基因的工程菌株。將天冬氨酸激酶基因（lysC）克隆至載體pTrc99A上，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC轉(zhuǎn)入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM11，以葡萄糖為底物搖瓶發(fā)酵，L-賴氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到1.55 g/L。相比原始菌株E.coli ML103產(chǎn)量只有0.0036 g/L，提高了430倍。將谷氨酸棒桿菌二氨基庚二酸脫氫酶基因（ddh）克隆至載體pACYCDuet-1上，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pACYCDuet-1

4、-ddh轉(zhuǎn)入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM12，以葡萄糖為底物搖瓶發(fā)酵，L-賴氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到1.38 g/L。
　　當(dāng)前工業(yè)化生產(chǎn)L-賴氨酸，對(duì)發(fā)酵液中的其它糖類利用不足，存在浪費(fèi)問(wèn)題，本論文將果糖-1，6-二磷酸酶基因（fbp）克隆至載體pTrc99A上，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pTrc99A-fbp轉(zhuǎn)入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM13，以果糖為底物搖瓶發(fā)酵，L-賴氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到1.06 g/L。

5、而原始菌株E.coli ML103幾乎不產(chǎn)L-賴氨酸。
　　為構(gòu)建多基因共表達(dá)的工程菌株。本論文在質(zhì)粒pTrc99A上克隆二氫吡啶二羧酸合成酶基因（dapA），構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pTrc99A-dapA；在重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC上克隆dapA基因，構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC-dapA。通過(guò)將重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC-dapA轉(zhuǎn)入E.coli ML103中，構(gòu)建工程菌株ZDZM21，L-賴氨酸產(chǎn)量最高達(dá)

6、到2.33 g/L，比工程菌株ZDZM11提高了50.32%。將重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC和pACYCDuet-1-ddh同時(shí)轉(zhuǎn)入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM22，L-賴氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到2.42 g/L，相比工程菌株ZDZM11提高了56.13%，比ZDZM12提高了74.98%。將重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-ddh和pTrc99A-dapA同時(shí)轉(zhuǎn)入E.coli ML103中，構(gòu)建工程菌株ZDZM23，L-賴

7、氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到2.58 g/L，比工程菌株ZDZM12提高了86.55%。而將重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC-dapA和pACYCDuet-1-ddh同時(shí)轉(zhuǎn)入E.coli ML103中，構(gòu)建工程菌株ZDZM24，L-賴氨酸產(chǎn)量最高達(dá)到2.98 g/L，比工程菌株ZDZM22提高了23.14%，比ZDZM23提高了15.5%，比原始菌株E.coli ML103提高了828倍。
　　本論文首次在過(guò)表達(dá)大腸桿菌自身關(guān)鍵酶基因的同時(shí)，