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文檔簡介
1、L-賴氨酸(L-Lysine)對人和動物的生長發(fā)育具有重要作用,由于不能通過轉(zhuǎn)氨作用合成,是人和動物的必需氨基酸之一,被稱為第一限制性氨基酸,廣泛應(yīng)用于食品加工,醫(yī)藥制劑,飼料添加劑等方面。目前世界市場對L-賴氨酸的年需求總量約為160余萬噸,年增長率大約為7%-8%,因此提高L-賴氨酸的產(chǎn)量就顯得十分重要。目前L-賴氨酸主要采用直接發(fā)酵法生產(chǎn),生產(chǎn)菌株主要是誘變育種得到的谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicu
2、m)突變菌株,存在生長速度緩慢,糖耗速率低,對外界不良環(huán)境耐受力差等缺點。本論文利用代謝工程技術(shù)構(gòu)建大腸桿菌(Escherichia coli,簡稱E.coli)工程菌株,采用發(fā)酵法進行L-賴氨酸的生產(chǎn),相比于背景尚不完全清楚的谷氨酸棒桿菌,基因操作較為簡單,有利于菌種的進一步改造;菌體生長周期較短,培養(yǎng)方便,對生長條件要求低的大腸桿菌,更適合工業(yè)化生產(chǎn)L-賴氨酸。
本論文首先構(gòu)建了過表達及異源表達L-賴氨酸生物合成途徑關(guān)鍵酶
3、基因的工程菌株。將天冬氨酸激酶基因(lysC)克隆至載體pTrc99A上,構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC轉(zhuǎn)入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM11,以葡萄糖為底物搖瓶發(fā)酵,L-賴氨酸產(chǎn)量最高達到1.55 g/L。相比原始菌株E.coli ML103產(chǎn)量只有0.0036 g/L,提高了430倍。將谷氨酸棒桿菌二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)克隆至載體pACYCDuet-1上,構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pACYCDuet-1
4、-ddh轉(zhuǎn)入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM12,以葡萄糖為底物搖瓶發(fā)酵,L-賴氨酸產(chǎn)量最高達到1.38 g/L。
當前工業(yè)化生產(chǎn)L-賴氨酸,對發(fā)酵液中的其它糖類利用不足,存在浪費問題,本論文將果糖-1,6-二磷酸酶基因(fbp)克隆至載體pTrc99A上,構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pTrc99A-fbp轉(zhuǎn)入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM13,以果糖為底物搖瓶發(fā)酵,L-賴氨酸產(chǎn)量最高達到1.06 g/L。
5、而原始菌株E.coli ML103幾乎不產(chǎn)L-賴氨酸。
為構(gòu)建多基因共表達的工程菌株。本論文在質(zhì)粒pTrc99A上克隆二氫吡啶二羧酸合成酶基因(dapA),構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pTrc99A-dapA;在重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC上克隆dapA基因,構(gòu)建成功重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC-dapA。通過將重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC-dapA轉(zhuǎn)入E.coli ML103中,構(gòu)建工程菌株ZDZM21,L-賴氨酸產(chǎn)量最高達
6、到2.33 g/L,比工程菌株ZDZM11提高了50.32%。將重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC和pACYCDuet-1-ddh同時轉(zhuǎn)入E.coli ML103中形成工程菌株ZDZM22,L-賴氨酸產(chǎn)量最高達到2.42 g/L,相比工程菌株ZDZM11提高了56.13%,比ZDZM12提高了74.98%。將重組質(zhì)粒pACYCDuet-1-ddh和pTrc99A-dapA同時轉(zhuǎn)入E.coli ML103中,構(gòu)建工程菌株ZDZM23,L-賴
7、氨酸產(chǎn)量最高達到2.58 g/L,比工程菌株ZDZM12提高了86.55%。而將重組質(zhì)粒pTrc99A-lysC-dapA和pACYCDuet-1-ddh同時轉(zhuǎn)入E.coli ML103中,構(gòu)建工程菌株ZDZM24,L-賴氨酸產(chǎn)量最高達到2.98 g/L,比工程菌株ZDZM22提高了23.14%,比ZDZM23提高了15.5%,比原始菌株E.coli ML103提高了828倍。
本論文首次在過表達大腸桿菌自身關(guān)鍵酶基因的同時,
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