強直性脊柱炎骨化相關(guān)易感基因的研究.pdf

1、第一部分：LRP5基因與強直性脊柱炎的相關(guān)性研究
　　 研究背景：
　　 強直性脊柱炎(Ankylosing spotadylitis，AS)是常見的炎癥性風濕疾病，主要累及中軸骨骼，引起特征性的后背炎性疼痛，并最終引起結(jié)構(gòu)和功能的破壞，影響病人的生活質(zhì)量。AS的發(fā)病率是0.3％，通常在病人20到30歲的時候發(fā)病，男性好發(fā)，男女發(fā)病比率大約是2-5:1，目前，并不清楚男性女性的自然發(fā)病過程為什么不同。遺傳因素促成了AS9

2、0％的遺傳易感性，HLA-B27和其他主要組織相容性復合體基因促成了AS50％的發(fā)病風險，但最近的研究表明除了B27以外的其他基因也促成了AS的發(fā)病機制。
　　 Wnt信號通路的作用涵蓋了胚胎的發(fā)生，腫瘤發(fā)生，血液學，干細胞，以至于最近發(fā)現(xiàn)的骨生物學。低密度脂蛋白相關(guān)受體5(LRP5)作為細胞膜表面的共受體，通過Wnt信號通路發(fā)揮自己的生物學功能。
　　 本項研究探索LRP5與AS的相關(guān)性，基于兩種假說。
　　

3、1)LRP5參與了AS病人骨量(BMP)和或骨形成的調(diào)節(jié)。
　　 LRP5的功能缺失性突變和功能獲得性突變分別與骨質(zhì)疏松-假性神經(jīng)膠質(zhì)瘤(OPPG)和高骨量(HBM)表型相關(guān)。此外，LRP5在普通人群的骨量調(diào)節(jié)中也發(fā)揮著重要的作用。晚期AS病人韌帶骨贅的形成，好像增高了骨量的評分，掩蓋了病人真實的椎體脫礦。更重要的是，病人的松質(zhì)骨和皮質(zhì)骨有著顯著的不同：松質(zhì)骨的骨量降低，導致了AS病人的椎體骨質(zhì)疏松，并增加了病人的骨折風險，然而

4、，病人的皮質(zhì)骨的特異性位點開始骨的增殖和肥厚?；谝陨嫌^察，可以看出，LRP5調(diào)節(jié)著骨量，而AS病人不但表現(xiàn)為骨質(zhì)疏松，也表現(xiàn)為病理性的骨形成。
　　 2)LRP5作為炎癥/骨化開關(guān)。
　　 Wnt信號通路在RA的發(fā)病機制中發(fā)揮著一定的作用。通過誘導骨保護素的表達，Wnt信號通路阻斷了破骨細胞的生成。在RA病人的滑膜組織，TNF通過誘導Wnt信號通路抑制子(DKK1蛋白)的表達，干擾了Wnt信號通路的傳導。通過誘導DKK

5、1的表達，Wnt信號通路受到抑制，隨后導致骨保護素的表達降低。在生理條件下，骨保護素通過連接RANKL，維持著骨吸收與骨形成之間的動態(tài)平衡。而在感染性關(guān)節(jié)炎，這種平衡傾向于RANKL生成的增多。我們假設(shè)LRP5在這里起著炎癥骨化開關(guān)的作用，在AS病人中，不依賴于DKK1而發(fā)揮著病理性作用。一方面，LRP5引起骨保護素的增高，抑制破骨細胞的骨吸收，另一方面，LRP5促進了成骨細胞的增殖和分化。
　　 研究目的：
　　 本研

6、究的目的就是要探討在中國漢族人群中，LRP5基因與AS的相關(guān)性。尤其是檢測LRP5基因內(nèi)或LRP5基因的上游(包括第一外顯子上游2000個堿基的啟動子區(qū)域，外顯子區(qū)域，外顯子和內(nèi)含子交接區(qū)域)是否有突變位點或新的多態(tài)位點。
　　 研究方法：
　　 研究對象：
　　 16個沒有血緣關(guān)系的AS病人(12個男性，平均年齡26.5±5.56歲)，研究這些病人的LRP5基因是否存在突變或新的變異。所有的研究對象都來自山東省

7、，漢族人群。根據(jù)84年紐約標準，由有醫(yī)師資格的風濕科醫(yī)生，對患者進行體格檢查及病史的詢問，進行臨床診斷。本項研究得到了相關(guān)倫理學委員會的批準，并對患者進行了書面的知情同意。
　　 基因測序：
　　 獲取16個病人的全血，用商品試劑盒提取DNA。應(yīng)用primer3在線軟件進行引物設(shè)計。經(jīng)過PCR產(chǎn)物純化后，我們用ABI3130測序儀，對LRP5基因進行了測序(包括第一外顯子上游2000個堿基，外顯子區(qū)域，外顯子和內(nèi)含子交接

8、區(qū)域)，對檢查的SNP位點用PolyPhred進行確認。
　　 結(jié)果：
　　 通過對LRP5進行直接測序，我們發(fā)現(xiàn)24個SNP位點，包括3個新的SNP位點。三個新的SNP位點，用PolyPhred軟件進行確認。三個新的SNP位點
　　 分別命名為LRP5SNP1(c.-1596T>C)，LRP5SNP2(c.3764-30G>A)和LRP5SNP3(c.4488+74G>A)，分別位于5’端，17內(nèi)含子和21內(nèi)含

9、子區(qū)域。此外，三個新的SNP位點的最小等位基因頻率分別為6.2％，9.4％和12.5％。LRP5SNP3位于內(nèi)含子21，離21外顯子73個堿基，距離rs2201466有20個堿基。沒有發(fā)現(xiàn)突變位點。
　　 結(jié)論：
　　 AS可能不存在LRP5的基因突變，對于三個新的SNP位點，需要大樣本量來驗證是否與AS的相關(guān)性。
　　 第二部分：軟骨內(nèi)骨化相關(guān)基因及異位骨化疾病基因與強直性脊柱炎相關(guān)性的研究
　　 研究

10、背景：
　　 強直性脊柱炎是一種高度遺傳，常見的風濕疾病，主要是中軸骨骼受累。特征的臨床癥狀是炎性背部疼痛，隨著時間的發(fā)展，發(fā)展為僵直和脊柱的失活動。AS病人相關(guān)的病理性骨形成是主要的健康問題，引起患者沉重的社會和經(jīng)濟負擔。所以，早期識別有骨化傾向的易感人群有著很重要的意義。
　　 目前，AS易感基因的研究主要在炎癥和免疫領(lǐng)域，對骨化進行研究的易感基因幾乎沒有，而骨化又是患者致殘的主要原因。TNF-a拮抗劑的應(yīng)用，對大多

11、數(shù)AS病人的臨床癥狀和全身的炎癥反應(yīng)有著長期的控制作用。然而etanercept和infliximab都不能在兩年的療程中減緩AS病人的放射學進展。這就使得研究者急需探討AS骨化相關(guān)的易感基因作為藥物干預的靶點。
　　 那么，除了炎癥和免疫相關(guān)的易感基因外，AS病人是否存在骨化相關(guān)的易感基因，以及我們?nèi)绾魏蜻x骨化相關(guān)易感基因。我們從以下幾點來考慮：
　　 1)炎癥與骨化存在著某種聯(lián)系，但在更大程度上是兩個相互獨立的過程，

12、骨化有著自己獨立的遺傳學基礎(chǔ)。
　　 2)AS的骨化實質(zhì)是軟骨內(nèi)骨化，組織病理學研究表明，軟骨內(nèi)骨化和直接的膜內(nèi)骨形成促成了脊椎關(guān)節(jié)病的骨僵直。
　　 3)AS的軟骨內(nèi)骨化存在著信號通路的失調(diào)，存在成骨與破骨的失偶聯(lián)。已經(jīng)確定了幾個信號通路參與了軟骨內(nèi)骨化過程，如Wnt信號通路、BMP信號通路、hedygehog信號通路以及基質(zhì)的礦化等。
　　 候選基因選取策略：
　　 1.通過對以往全基因組掃描結(jié)果進行

13、薈萃分析，選擇在易感區(qū)域內(nèi)的異位骨化相關(guān)基因(BMP6、RUNX2、IHH、COL11A2、ENPP1)；
　　 2.，參與軟骨內(nèi)骨化相關(guān)信號通路內(nèi)的重要基因(Wnt信號通路：LRP5、DKK1；BMP信號通路：BMP6、BMP2、BMP4；基質(zhì)礦化通路：DMP1、ENPP1、MG：hedgehog信號通路：IHH；骨化相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子：RLJNX2、SOX9)；
　　 3，異位骨化相關(guān)疾病的易感基因(ACVR1、COL11

14、A2)；
　　 4，治療異位骨化有效的靶點(PTGS2)；
　　 5，其他人群全基因組掃描陽性位點基因(ANTXR2)
　　 最終，我們選擇了15個候選基因進行與AS的相關(guān)性研究。
　　 實驗?zāi)康模?br>　　 尋找AS異位骨化相關(guān)的易感基因，為AS的治療提供的新的治療靶點，抑制AS的病理性骨形成，減少AS病人的致殘率。
　　 研究方法：
　　 研究對象：
　　 300個病人，1

15、80個與病人組種族相匹配的健康對照人群。所有的病人和健康人群都來自山東漢族人群，年齡范圍在11到70歲之間。病人的診斷標準符合84年的紐約診斷標準，病人的骨盆和腰骶部脊柱的影像學由影像學專家來檢查。系統(tǒng)的收集病人的臨床信息，包括，性別、發(fā)病年齡、B27陰性陽性、駝背、竹節(jié)樣改變以及影像學分級等。在濟南市中心血站收集180例種族匹配、無親緣關(guān)系的健康對照人群。
　　 基因分型：
　　 自肘靜脈抽取外周血，抗凝處理后，提取全

16、血基因組DNA。用illmuminagoldengate基因分型平臺對300個病人，180個對照進行基因分型。
　　 SNP選擇：
　　 用Haploview4.0，選擇涵蓋所選基因的整個基因區(qū)域(包括第一外顯子上游3000個堿基)的TagSNP(r2>0.8)，在一個BLOCK區(qū)域內(nèi)，優(yōu)先選擇位于啟動子區(qū)域、編碼區(qū)、剪切區(qū)域的位點，優(yōu)先選擇錯意變異和無意變異位點。位于LRP5基因的rs41494349，rs373622

17、8，LRP5SNP1，LRP5SNP2，LRP5SNP3以及其他與異位骨化相關(guān)的SNP位點，被強行加入到TagSNP里面。最終，總共選擇了96個SNP位點。
　　 統(tǒng)計學分析：
　　 去除檢測缺失率大于0.1的SNPs位點。只在對照組進行Hardy-Weinberg平衡檢驗?；蛐秃偷任换蛐偷谋容^用fisher chi-square檢驗。優(yōu)勢比和95％的置信區(qū)間用來計算不同等位基因的效應(yīng)。等位基因相關(guān)關(guān)系檢驗用PLIN

18、K1.06?；蛐?、單體型分析用SHEsis在線軟件。P值小于0.05有統(tǒng)計學意義。
　　 結(jié)果：
　　 1).入選標準
　　 經(jīng)過正常組中哈溫平衡(p>0.05)，最小等位基因頻率(maf>0.05)，單個樣本snp檢出率(callrate>0.9)，單個位點檢出率(call freq>0.9)的篩選標準，最終選擇296例病例，170例正常對照樣本；最終選擇SNP位點84個。
　　 2).實驗的質(zhì)量控制

19、
　　 檢驗基因分型準確性，進行質(zhì)量控制，在實驗樣本中隨機選取10個復制樣本，結(jié)果復制準確率在96％以上。
　　 3).關(guān)聯(lián)分析
　　 ①.病例對照的關(guān)聯(lián)分析
　　 A).病例對照單個位點的關(guān)聯(lián)分析
　　 有統(tǒng)計學意義的位點有7個，分別位于6個基因上。第一個是rs10019009，位于基因DMP1上；第二個是LRP5SNP3，位于LRP5上；第三個位點是rs16873348，位于基因RUNX2上；

20、第四個位點是rs35565233，也位于RUNX2基因上；第五個位點rs6910759，在BMP6基因上；第六個位點是rs3178250，在BMP2基因上；第七個位點是rs6935458，位于基因ENPP1基因上。
　　 B).病例對照的基因型分析
　　 有三個位點，位于兩個基因上，有DMP1的rs10019009，RUNX2的rs16873348和RUNX2的rs35565233。
　　 C).病例對照的單個基

21、因的單體型分析，有9個基因存在有意義的單體型。分別是DMP1、RUNX2、BMP6、BMP2、ANTXR2、ACVR1、ENPP1、LRP5、PTGS2。
　　 ②.病例組內(nèi)部分析
　　 A).與竹節(jié)樣改變相關(guān)的等位基因型分析
　　 與竹節(jié)樣改變相關(guān)的SNP位點有6個，包括ACVR1的rs7595478，RUNX2的rs7750470，BMP6的rs267180，BMP6的rs267205，BMP2的rs2357

22、68，BMP2的rs6054512。
　　 B).與竹節(jié)樣改變相關(guān)的基因型分析
　　 SNP位點有5個。包括ACVR1的rs7595478，RUNX2的rs7750470，BMP6的rs267180，BMP6的rs267205，BMP2的rs6054512。
　　 C).與駝背相關(guān)的等位基因型分析
　　 SNP位點有RUNX2的rs2820339，RUNX2的rs7750470，RUNX2的rs12665

23、622，BMP2的rs6054512。
　　 D).與影像學3、4級相關(guān)的等位基因型分析
　　 SNP位點有RUNX2的rs2820339，RUNX2的rs7750470，RUNX2的rs12665622，BMP6的rs1225930。
　　 E).與疾病早發(fā)相關(guān)(20歲以前發(fā)病)的等位基因型分析
　　 SNP位點有IHH的rs7592246，BMP6的rs1358893。
　　 F).與男性發(fā)病

24、相關(guān)的等位基因型分析
　　 SNP位點有ANTXR2的rs4333130，BMP6的rs198354，LRP5的rs686921。
　　 ③.對照組內(nèi)部的相關(guān)性分析
　　 A、在對照組中，男女性別差異的等位基因型分析
　　 SNP位點有LRP5的rs686921，ANTXR2的rs12651388，MGP的rs4236。
　　 結(jié)論：
　　 1.DMP1、ENPP1基因可能是通過基質(zhì)的礦化

25、機制參與了AS的發(fā)病
　　 2.支持了Wnt信號通路參與AS的發(fā)病這一理論。
　　 3.BMP6、BMP2、RUNX2可能通過BMP信號通路參與了AS的發(fā)病以及異位骨化的形成。
　　 4.FOP與AS可能有著相似的異位骨化機制
　　 5.環(huán)氧合酶2參與了AS的發(fā)病
　　 6.IHH和BMP6與AS的病情早發(fā)相關(guān)
　　 7.ANTXR2、LRP5和BMP6與男性發(fā)病相關(guān)
　　 第三部

26、分 LRP5SNP3位點功能的研究
　　 研究目的：
　　 LRP5SNP3位于內(nèi)含子21，在外顯子21下游73bp個堿基，在SNP位點rs2201466下游20個堿基，我們假設(shè)LRP5SNP3可能是通過影響了內(nèi)含子和外顯子之間的剪切，參與了AS的發(fā)病。實驗?zāi)康?，探討LRP5SNP3是否影響了LRP5的內(nèi)含子和外顯子之間的剪切。
　　 研究方法：
　　 剪切位點預測軟件。
　　 應(yīng)用軟件1.Net

27、Gene2(NG2)2.Automated Splice-Site Analysis(ASSA)3.MaxEntScan(MES)來預測LRPSSNP3是否影響了LRP5 mRNA的剪切，從而影響LRP5的功能。
　　 RT-PCR
　　 應(yīng)用軟件primer5設(shè)計引物，設(shè)計三對引物。第一對引物位于外顯子3；第二對上游引物位于外顯子20，下游引物位于外顯子22；第三對上游引物位于外顯子20，下游引物位于外顯子22。GAP

28、DH作為內(nèi)對照。應(yīng)用商品化試劑盒提取病人及健康人外周血，兩步法進行RT-PCR實驗。
　　 結(jié)果：
　　 1.通過軟件預測，LRP5SNP3沒有影響到LRP5 RNA的剪切。
　　 2.通過RT-PCR沒有檢測到LRP5在健康人體內(nèi)的表達。
　　 結(jié)論：
　　 1.LRP5在外周血中表達比較低，在外周血總RNA提取過程中，RNA可能降解。
　　 2.LRP5SNP3可能是通過其他方式參與了

29、AS的發(fā)病，比如：影響了LRP5的表達等。
　　 3.對LRP5SNP3的研究可能需要非編碼DNA、RNA來研究。
　　 第四部分 DMP1基因rs10019009位點與強直性脊柱炎相關(guān)性的實驗驗證研究
　　 研究背景：
　　 我們在第二部分的300例病人，180例對照的研究中，發(fā)現(xiàn)DMP1基因的rs10019009位點與AS病人有著很強的相關(guān)性，p=0.001229，OR=0.64。95％CI[0.49

30、-0.84]。
　　 DMP1是一種細胞外基質(zhì)蛋白，是小整合連接配體N-連接糖蛋白家族成員，對骨及牙本質(zhì)的正常礦化起著重要的作用，在骨及牙組織中表達。DMP1蛋白中包含很多的酸性結(jié)構(gòu)域，多磷酸化位點，功能性的精氨酸-甘氨酸-半胱氨酸的細胞粘附序列，還含有一個DNA連接序列。在未分化的成骨細胞，它主要作為核蛋白調(diào)節(jié)著成骨細胞特異性基因的表達。在成骨細胞成熟階段，蛋白被磷酸化，然后，轉(zhuǎn)移到細胞外基質(zhì)。在細胞外基質(zhì)，DMP1參與了礦化

31、基質(zhì)的形成。DMP1基因突變引起常染色體隱性低磷酸鹽血癥性佝僂病。
　　 研究目的：
　　 rs10019009，是個錯意變異位點A-T，導致了絲氨酸向半胱氨酸的改變，位于69位氨基酸位置，67-83位氨基酸是DMP1基因的第一保守區(qū)，糖胺聚糖區(qū)域，該區(qū)域?qū)MP1的礦化成核起著重要的作用。由此，我們認為rs10019009可能是導致AS發(fā)病的一個功能位點，所以，對rs10019009位點進行實驗驗證。
　　 研

32、究方法：
　　 研究對象：從省立醫(yī)院、山東省中醫(yī)院、濟寧醫(yī)學院附屬醫(yī)院和臨沂市人民醫(yī)院，收集AS病例350例，所以病例符合84年紐約診斷標準。從濟南市中心血站收集健康人血液400例。
　　 DNA的提?。?br>　　 提取外周血基因組DNA。靜脈血250μ1，采用Omega E-Z96血液基因組DNA提取試劑盒(E-Z96 Blood DNA Kit)提取血液DNA，具體操作見DNA提取試劑盒。用Merinton SM

33、A1000分光光度計測定DNA濃度，終濃度達到100ng/μ l，所測A260/A280值為1.65-1.80。將DNA稀釋到20-50ng/μ l，-40°保存?zhèn)溆谩?br>　　 基因分型：
　　 采用TaqMan-PCR的方法基因分型，位點探針由生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems)合成。反應(yīng)體系10μl，包括探針Mix，Lightcycler480 ProbeMaster、PCR Grade H2O和DNA

34、樣品，反應(yīng)在Lightcycler480 PCR儀上進行。Endpoint Genotyping法分析結(jié)果。用在線軟件SHEsis和SPSS11.5軟件包進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計過程排除基因分型失敗個體。
　　 結(jié)果：
　　 病例對照的相關(guān)性分析：
　　 1.rs10019009 SNP位點與AS的相關(guān)性沒有統(tǒng)計學意義，p=0.242，但風險型等位基因T與AS病人連鎖不平衡。
　　 2.實驗第一部分的人群和實驗

35、第二部分的人群合在一起，進行病例對照分析，rs10019009與AS有著很強的相關(guān)性，經(jīng)過多重檢驗校正后，p值仍然小于0.05。
　　 結(jié)論：
　　 Rs10019009是DMP1重要的SNP位點，可能參與了AS的發(fā)病。
　　 第五部分 DMP1基因的rs10019009位點對U20S細胞礦化機制的研究
　　 研究目的：
　　 探討SNP位點rs10019009位點，參與U20S細胞礦化的機制，從

36、而為控制AS的骨化，提供作用靶點。
　　 研究方法：
　　 1.用蛋白質(zhì)分析軟件，分析DMP1的三級結(jié)構(gòu)，功能保守區(qū)，與活性位點區(qū)域。用SNP功能預測軟件，預測rs10019009，對DMP1功能的影響。
　　 2.U20S細胞的培養(yǎng)。U20S細胞是低磷酸酶活性，沒有礦化能力的人類成骨樣細胞。RT-PCR檢測沒有轉(zhuǎn)染外源基因的U20S細胞的DMP1表達水平。
　　 3.質(zhì)粒構(gòu)建。構(gòu)建pEGFP-N1-DM

37、P1表達質(zhì)粒。定點誘變rs10019009位點，堿基a(絲氨酸)-堿基t(半胱氨酸)-堿基c(精氨酸)堿基g(甘氨酸)。并將定點誘變后的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到U20S細胞。
　　 4.實驗分組。分為加礦化誘導劑組和未加礦化誘導劑組，轉(zhuǎn)染DMP1組和未轉(zhuǎn)染組，并在不同的組中，細胞培養(yǎng)0天，48小時，5天進行細胞表型檢測。
　　 5.細胞表型檢測。茜素紅染色檢測U20S細胞的礦化結(jié)節(jié)；堿性磷酸酶檢測ALP活性；RT-PCR檢測ALP、D

38、MP1、骨鈣素、RUNX2、BMP2、BMP6的表達水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.rs10019009位于DMP1的保守區(qū)，對DMP1的功能產(chǎn)生一定的影響。
　　 2.成功定點誘變了rs10019009 SNP位點，并成功轉(zhuǎn)染到U20S細胞，轉(zhuǎn)染效率75％。
　　 3.未檢測到?jīng)]有轉(zhuǎn)染外源基因的U20S細胞表達DMP1。
　　 4.ALP活性檢測，發(fā)現(xiàn)T等位基因(風險型等位基因的)活性比A等位基