ANKH基因與強(qiáng)直性脊柱炎異位骨化的相關(guān)性研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 AS患者與脊柱損傷患者的韌帶組織在成骨礦化程度和ANKH基因含量間的比較
　　目的：比較AS實(shí)驗(yàn)組與JK對(duì)照組韌帶組織間的成骨礦化差異。探討ANKH是否參與了AS異位骨化的形成。
　　方法：分別取AS韌帶做實(shí)驗(yàn)組，脊柱損傷患者的韌帶組織做正常對(duì)照組，利用HE染色、茜素紅染色和馮庫(kù)薩染色觀察各組織的大體形態(tài)和礦化程度。同時(shí)行免疫組織化學(xué)技術(shù)對(duì)ANKH的表達(dá)進(jìn)行定位分析，以及行RT

2、-PCR技術(shù)檢測(cè)兩組織間ANKH表達(dá)是否存在差異。
　　結(jié)果：兩種組織HE染色均可見(jiàn)含有較大量的成纖維細(xì)胞，且細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)明顯差異。茜素紅染色和馮庫(kù)薩染色結(jié)果顯示AS關(guān)節(jié)韌帶附著端有明顯的礦化，而正常人未見(jiàn)礦化。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)ANKH主要定位在細(xì)胞膜，且其在韌帶成纖維細(xì)胞中有較高表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn):ANKH基因在AS實(shí)驗(yàn)組與JK對(duì)照組間有明顯差異，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：AS患者韌帶異位骨化

3、起始于關(guān)節(jié)韌帶附著點(diǎn)處，且韌帶骨化組織間存在較大量的成纖維細(xì)胞。AS患者的韌帶組織中ANKH表達(dá)較少，ANKH基因可能在AS患者韌帶組織的異位成骨過(guò)程中起到重要作用。
　　第二部分 原代成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及兩種組織的成纖維細(xì)胞間成骨礦化能力和ANKH基因含量的比較
　　目的：掌握簡(jiǎn)單高效的原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的方法。比較兩組成纖維細(xì)胞間的成骨礦化能力，研究ANKH基因是否參與了AS異位骨化的形成及其可能的參與機(jī)制。
　　方

4、法：兩組韌帶組織的原代成纖維細(xì)胞均采用組織塊貼壁法培養(yǎng)獲得，并鏡下觀察兩組原代細(xì)胞的形態(tài)。取第三代細(xì)胞行免疫熒光技術(shù)鑒定成纖維細(xì)胞的含量。分別取兩組的第三代成纖維細(xì)胞進(jìn)行礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)，并通過(guò)檢測(cè)ALP活力變化及茜素紅染色來(lái)對(duì)比兩組成纖維細(xì)胞成骨分化、礦化能力的大小。同時(shí)行RT-PCR檢測(cè)兩組韌帶成纖維細(xì)胞間ANKH表達(dá)是否存在差異。
　　結(jié)果：通過(guò)組織塊貼壁培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出韌帶成纖維細(xì)胞，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)未見(jiàn)差異，經(jīng)波形蛋白免疫熒

5、光鑒定成纖維細(xì)胞含量在99％以上。堿性磷酸酶(ALP)活性檢測(cè)及茜素紅染色結(jié)果均顯示，兩組細(xì)的胞外ALP分泌均增加，并形成一定數(shù)量的礦化小結(jié)節(jié)，但AS實(shí)驗(yàn)組的胞外ALP分泌量及礦化小結(jié)節(jié)數(shù)量均較JK對(duì)照組高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AS患者韌帶成纖維細(xì)胞ANKH基因表達(dá)明顯少于JK對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：組織塊貼壁培養(yǎng)法可以簡(jiǎn)單高效的培養(yǎng)出高純度的韌帶成纖維細(xì)胞，韌