快速特異檢測大腸桿菌0157：H7的B細胞生物傳感器研究.pdf

1、微生物污染引起的食物中毒是國內外食品安全領域中的主要問題，目前急需發(fā)展一個新型、快速、特異和靈敏的檢測食品中致病菌的方法。本課題結合細胞生物學、免疫學、光學等技術領域的最新成果，以大腸桿菌O157∶H7（Escherichiacoli O157∶H7）為模式菌，探討了以B細胞作為生物傳感器受體元件檢測食源性致病菌的可能性，并研究了兩種基于B細胞的生物傳感器技術。
　　1.E.coli O157∶H7和B細胞的相互作用
　　研

2、究了特異性表達抗E.coli O157的IgM的B細胞作為生物傳感器中識別元件的生長特性和IgM的活性。用流式細胞術研究B細胞捕獲不同濃度E.coliO157∶H7的情況，以及B細胞與E.coli O157∶H7孵育不同時間后的活力。結果顯示，該B細胞具有IgM活性，當與E.coli O157∶H7孵育1小時，不同濃度細菌對B細胞活力均無影響;表明該B細胞可以作為生物傳感器中的生物識別元件用于構建基于細胞的生物傳感器進行食源性大腸桿菌檢

3、測。
　　2.基于化學鈣離子指示劑B細胞生物傳感器的構建
　　該試驗目的是開發(fā)一個基于化學鈣離子指示劑的B細胞生物傳感器。當加載了Fura-2的B細胞與菌體接觸后，B細胞受體(B cell receptor，BCR)介導的鈣離子信號通路被激活，由此導致胞質內鈣離子濃度在數(shù)秒內升高，高濃度鈣離子與Fu ra-2進行結合從而導致其熒光信號的改變以報道靶標致病菌的存在。本試驗中的B細胞生物傳感器在30μL體系中，可以檢測E.col

4、i O157∶H7的菌體數(shù)量低至18個細胞，檢測范圍為102至105 CFU/mL，檢測時間從樣品準備到檢測可在10 min左右完成。最后，用該B細胞生物傳感器對非靶標致病菌和食品樣品中的E.coli O157∶H7進行了檢測，發(fā)現(xiàn)該傳感器顯示出了優(yōu)良的特異性。
　　3.基于遺傳工程鈣離子指示劑B細胞生物傳感器的構建
　　在該試驗中，使用一個遺傳編碼的鈣離子指示劑(genetically encoded Ca2+indica

5、tors，GECI)作為報告子，構建了一個基于熒光共振能量轉移(fluorescenceresonance energy transfer，F(xiàn)RET)的B細胞生物傳感器。當E.coli O157∶H7與B細胞膜表面的IgM結合時會激活BCR介導的鈣離子信號通路，導致胞內鈣離子濃度的瞬時增強，繼而觸發(fā)GECI TN-XXL的FRET發(fā)生以報告致病菌的存在。結果證實TN-XXL和基于FRET的方法構建出的B細胞生物傳感器用于檢測靶標致病菌具