食品中單增李斯特菌快速檢測方法的建立與應用.pdf

1、單核細胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes，LM)是一種重要人畜共患病的病原體，主要污染肉、蛋、奶、水果和蔬菜等。我國單增李斯特菌的檢測主要是選用傳統(tǒng)培養(yǎng)法，基于快速、準確檢測的目的，免疫學與分子生物學檢測技術迅速發(fā)展。
　　本研究主要依據(jù)國家食品安全檢測標準GB4789.30-2010，結合一系列的快速檢測技術，如顯色培養(yǎng)基、蛋白條檢測法、CPA恒溫擴增法、實時熒光PCR方法以及全自動微生物分析系統(tǒng)等，

2、完成對樣品的進行快速、準確檢測。
　　研究中選用單增李斯特菌純菌以及四種典型的即食食品（肉類、海產(chǎn)品、奶制品以及水果和蔬菜），對國內外常用的四類核酸提取方法（沉降法、磁珠法、離心柱法以及熱解法）進行方法比對，選擇穩(wěn)定性好、特異性強的方法作為后期核酸提取的首選方法。研究表明，離心柱法操作簡單，穩(wěn)定性好，靈敏度和特異性高，對實驗人員的操作和經(jīng)驗要求不高，易于掌握。
　　利用標準菌株對3種單增李斯特菌快速檢測方法的靈敏度、特異性進

3、行比對，然后選取典型即食食品鹽水鴨和涼拌菜，通過人工布菌的方法對3種方法進行深入比較研究。結果表明，蛋白條檢測法操作簡單，但靈敏度低；CPA恒溫擴增法克服了蛋白條檢測法靈敏度低的不足，不需要大型的檢測儀器，適用于基層實驗室；實時熒光PCR方法的靈敏度高、特異性好，同時還避免了常規(guī)PCR需要進行電泳的過程，減少交叉污染的風險，檢測周期短，已經(jīng)廣泛應用于實驗條件比較完備的實驗室。
　　單增李斯特菌檢測中死/活菌的檢測是一個難題，排除死

4、菌核酸對檢測結果的影響顯得極其重要。實驗中選用PMA進行死/活菌檢測的研究，結果表明在純培養(yǎng)物中PMA可以較好的排除死菌的干擾，提高檢測的準確性，但在基質干擾情況下效果不理想，很容易受到雙鏈非目標基因的影響，造成PMA的大量損耗，影響檢測結果。
　　基于以上研究，將核酸提取技術與快速檢測方法相結合，建立食品中單增李斯特菌快速檢測方法，并通過對大量實際樣品檢測進行方法的驗證與優(yōu)化。操作步驟：按照GB4789.30-2010對樣品進行