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文檔簡介
1、目的:單增李斯特菌表面蛋白MurA可作為檢查的標(biāo)志分子,原核表達(dá)MurA,制備鼠多克隆抗體,將抗體與磁珠偶聯(lián)制成單增李斯特菌免疫磁珠,將免疫磁珠富集技術(shù)結(jié)合選擇性平板培養(yǎng)法,建立免疫磁珠-選擇性平板快速檢測技術(shù),以縮短增菌耗時和提高特異性。
方法:設(shè)計(jì)MurA蛋白的基因引物,PCR擴(kuò)增后,將MurA基因插入原核表達(dá)載體pET28a(+)中,轉(zhuǎn)化大腸桿菌進(jìn)行優(yōu)化表達(dá);表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)鎳柱純化,質(zhì)譜分析后免疫小鼠,制備抗MurA的多克隆
2、抗體;通過間接ELISA方法,分析多抗效價及交叉性;用多抗制備MurA特異性免疫磁珠,建立單增李斯特菌免疫磁珠-選擇性培養(yǎng)基檢測方法,并對人造污染牛奶樣品進(jìn)行檢測。
結(jié)果:上清中見72kD的可溶性誘導(dǎo)蛋白表達(dá),經(jīng)質(zhì)譜鑒定其為MurA蛋白;3次免疫小鼠后,MurA抗血清效價達(dá)1:10000,與傷寒沙門氏菌、副溶血弧菌、大腸桿菌及屬內(nèi)其它病原菌均無交叉反應(yīng),顯示了良好的特異性;用該抗血清制備的免疫磁珠結(jié)合選擇性培養(yǎng)基檢測法。單增李
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