木糖還原酶基因克隆及表達(dá)菌株的代謝工程改造.pdf

1、木糖醇是一種五碳糖醇，其化學(xué)名稱為1，2，3，4，5-戊醇，分子式為C5H12O5，是一種白色結(jié)晶，它的溶解度、溶液密度和折光系數(shù)等理化性質(zhì)與蔗糖基本相同，可以作為蔗糖的替代品和糖尿病人的營養(yǎng)劑而受到人們的關(guān)注。
　　本文首先通過PCR從粗糙脈胞菌（Neurosporacrassa）基因組中獲得目的基因木糖還原酶基因(xr)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pET30a-xr，并分析重組質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中的表達(dá)情況。結(jié)果表明分子量

2、大小為38kDa的木糖還原酶(XR)能有效表達(dá)，重組菌株XR的比酶活為7.25U/mg。
　　其次，XR為NADPH依賴型的酶，本文通過PCR從大腸桿菌K-12基因組中分別獲得輔酶再生基因6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶基因（gnd）和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶基因(zwf)，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pCDFDuet-gnd、pCDFDuet-zwf、pCDFDuet-gnd-zwf，并分析重組質(zhì)粒在E.coliBL21(DE3)中的表達(dá)情況。結(jié)果表明分子

3、量大小為51kDa的6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6-PGDH)、54kDa的葡萄糖6-磷酸脫氫酶(G6PDH)均得到有效表達(dá)，重組菌株6-PGDH的比酶活為2.26U/mg，G6PDH的比酶活為1.31U/mg。論文通過共表達(dá)pET30a和pCDFDuet-1系列的載體，強(qiáng)化了NADPH的再生，提高木糖醇的轉(zhuǎn)化效率。
　　在此基礎(chǔ)上，論文優(yōu)化了表達(dá)細(xì)胞的木糖代謝途徑，采用Red/ET技術(shù)成功敲除了大腸桿菌基因組中D-木酮糖激酶(XK)

4、的基因(xylB)，減弱了木糖通過木酮糖的磷酸化生成5-磷酸-D-木酮糖進(jìn)入磷酸戊糖途徑，被菌體生長代謝利用。論文通過比較xylB基因敲除前后木糖對(duì)木糖醇的轉(zhuǎn)化率，明確了基因敲除對(duì)提高木糖的利用效率和木糖醇產(chǎn)率的作用。
　　最后，論文通過對(duì)培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件（種齡、初糖濃度、溫度、pH和接種量等）的優(yōu)化，獲得了工程菌生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)木糖醇的最佳條件:種齡為12h，初糖濃度為60g/L，溫度為28℃，pH為7.0，接種量為10％。搖瓶