熱帶假絲酵母木糖還原酶基因（XYL1）的克隆、表達(dá)純化及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、木糖是自然界第二豐富的碳水化合物(僅次于葡萄糖)。要有效利用木糖就要通過(guò)生物轉(zhuǎn)化法，既微生物或者酶的催化將原料轉(zhuǎn)化為更有附加價(jià)值的產(chǎn)物。許多微生物都能夠?qū)⒛咎亲鳛橐环N碳源來(lái)利用。但是只有一小部分能夠發(fā)酵木糖，并且副產(chǎn)物多，對(duì)高濃度代謝產(chǎn)物的耐受性差，都不利于進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵。因此通過(guò)代謝工程獲得更好的能夠發(fā)酵木糖的工程菌是非常有吸引力的一條途徑。例如能夠發(fā)酵木糖的酵母工程菌，因?yàn)榻湍父舆m合大規(guī)模的發(fā)酵。天然酵母同化木糖的關(guān)鍵是木糖還原酶

2、(EC 1.1.1.21)，它在輔酶NADH或NADPH存在的情況下能夠?qū)-木糖還原成木糖醇。大部分木糖還原酶特異依賴(lài)NADPH，有一些則是需要利用NADH和NADPH，此外還有一些是偏好NADH的。盡管木糖還原酶不同的輔酶偏好性會(huì)影響木糖代謝工程菌的代謝流向，使其偏向于木糖醇積累或乙醇產(chǎn)生。但是想要通過(guò)基因改造獲得能夠更好的利用木糖的酵母工程菌，首先就要獲得木糖轉(zhuǎn)化率高的木糖還原酶，然后根據(jù)其輔酶的偏好性構(gòu)建木糖代謝工程菌。在本實(shí)驗(yàn)

3、室前期通過(guò)比較現(xiàn)有的一些酵母菌木糖醇發(fā)酵情況，已篩選出一株發(fā)酵純木糖時(shí)木糖醇得率為47.30[％]，在優(yōu)化發(fā)酵條件后得率70.91[％]的高產(chǎn)出發(fā)菌株熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)AY92045的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步研究取得如下成果： 1．C. tropicalis AY92045木糖還原酶酶活初步測(cè)定。通過(guò)比色法測(cè)定C．tropicalis AY92045木糖還原酶粗提液的比酶活，發(fā)現(xiàn)它能夠利用2種輔酶，且

4、NADH：NADPH活力比為0.715。而已報(bào)道來(lái)源于C.tropicalis IFO 0618的木糖還原酶只能利用NADPH為輔酶。為了確定該酶的輔酶偏好性，為下一步構(gòu)建木糖代謝工程菌奠定基礎(chǔ)，本試驗(yàn)從基因和蛋白水平上對(duì)其做進(jìn)一步研究。 2．C. tropicalis XYLl基因的克隆及序列分析。根據(jù)已報(bào)道序列克隆了C tropicalisAY92045中XYLl基因，其大小為975bp。通過(guò)生物信息學(xué)分析，

5、克隆所得XYLl基因與已報(bào)道的來(lái)源于C.tropicalis IFO 0618的木糖還原酶基因XYRA和XYRB的同源性相似性分別為98.5％和98.1％。其中XYRA與XYRB中的Pro4，Thr5，Ile6和Glu70分別被Val，Asn，Thr和Asp所代替。此外XYLl中的Thr29和Ala31與XYRA中的相同，而Ser249則與XYRB中的相同。 3．C. tropicalisXYLl基因在大腸桿菌中的表達(dá)及蛋白

6、純化。為了更好的研究C．tropicalis AY92045木糖還原酶的功能以及驗(yàn)證其是否真的能夠利用NADH，將克隆得到的木糖還原酶基因ORF片段插入到大腸桿菌表達(dá)載體pET-32a中，構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET32a—XYLl并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。通過(guò)不同IPTG濃度，不同誘導(dǎo)時(shí)間和不同誘導(dǎo)溫度進(jìn)行小量表達(dá)，得到最優(yōu)表達(dá)條件為：終濃度為0.3mmol/L的IPTG，37℃搖床培養(yǎng)4h。高效表達(dá)后，通過(guò)Ni親和層析柱純化出大

7、量融合蛋白，其大小為57.5kDa。在酶切并再次純化后，SDS-PAGE結(jié)果顯示出一條帶，重組木糖還原酶的比酶活為109.7μmol/min·mg。 4．C.tropicalls重組木糖還原酶酶動(dòng)力學(xué)測(cè)定及分析。分別測(cè)定了純化出的重組木糖還原酶的各項(xiàng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，并研究其基本性質(zhì)。該酶的最適pH在5.5左右，最適溫度在40-50℃之間，其最佳底物是五碳糖。能夠利用NADPH和NADH，但更偏好于NADPH,其KmNADPH為4

8、5.5μmol/L， VmaxNADPH為322.58μpmol/min·mg-protein；KmNADH為161.9μmol/L，VmaxNADH1.54μmol/min·mg-protein。通過(guò)對(duì)正向酶活和逆向酶活的測(cè)定發(fā)現(xiàn)它對(duì)木糖的催化效率相當(dāng)高，且專(zhuān)一性好Kcat為14.4×10<'3>/min，Kcat/Km為457(mmol/L)/min；KmNADP<'+>為97μmol/L， Vmax為0.18μmol/min·mg