羰基還原酶的挖掘和改造.pdf

1、手性醇被廣泛用于合成手性藥物、精細(xì)化學(xué)品和農(nóng)用化學(xué)品，是最重要的手性砌塊之一。生物催化潛手性酮不對(duì)稱還原合成手性醇因具有理論產(chǎn)率高、選擇性好、副產(chǎn)物少和反應(yīng)條件溫和等優(yōu)點(diǎn)而成為手性醇綠色合成的優(yōu)選途徑。然而，大多數(shù)生物催化劑還原潛手性酮的過(guò)程遵循Prelog規(guī)則，具有anti-Prelog立體選擇性的生物催化劑相對(duì)稀缺。鑒于此，本論文以開發(fā)高效的anti-Prelog立體選擇性生物催化劑為目標(biāo)，開展了包括菌種篩選、基因挖掘、蛋白表達(dá)、酶

2、催化性質(zhì)表征和理性設(shè)計(jì)改造酶催化性能等方面的研究。
　　利用傳統(tǒng)菌種篩選策略，從土壤中分離得到具有anti-Prelog立體選擇性的微生物菌株ZJUY-1401;經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析，確定該菌株為短穩(wěn)桿菌(Empedobacter brevis)。短穩(wěn)桿菌ZJUY-1401能夠高立體選擇性不對(duì)稱還原一系列苯乙酮衍生物，催化底物譜寬泛;另一方面，該菌株可利用相對(duì)廉價(jià)的NADH作為輔酶，且能夠以乙醇作為輔底物實(shí)現(xiàn)輔

3、酶再生，具有良好的乙醇耐受性和pH適應(yīng)性，因而具備了anti-Prelog手性醇高效合成工具的潛質(zhì)。
　　通過(guò)基因組狩獵法分別從E.brevis ZJUY-1401和Pseudomonas putida ATCC12633基因組中挖掘并克隆了羰基還原酶基因Ebsdr8和Ppysdr，并成功實(shí)現(xiàn)了相應(yīng)編碼蛋白EbSDR8和PpYSDR在E.coli BL21(DE3)中的異源表達(dá)。氨基酸序列分析表明兩者均屬于短鏈脫氫酶家族，具有該家

4、族蛋白高度保守的富甘氨酸“指紋”序列GXXXGXG、催化三聯(lián)體Ser-Tyr-Lys和活性位點(diǎn)模體YXXXK。EbSDR8不對(duì)稱還原苯乙酮的產(chǎn)物為(R)-苯乙醇，ee值高達(dá)99.9％;而PpYSDR催化苯乙酮還原的主要產(chǎn)物為(S)-苯乙醇，ee值為84.2％。為了便于在后續(xù)研究中深入認(rèn)識(shí)兩個(gè)酶催化性能和結(jié)構(gòu)間關(guān)系，通過(guò)同源建模分別構(gòu)建了具有高可信度的三級(jí)結(jié)構(gòu)模型，兩者均具有短鏈脫氫酶家族蛋白典型的Rossmann折疊結(jié)構(gòu)。
　　考

5、察EbSDR8和PpYSDR的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，兩者均可利用NADH和NADPH作為輔酶催化潛手性酮的還原，但NADH作為輔酶時(shí)的催化性能優(yōu)于NADPH;兩者均能以異丙醇作為輔底物實(shí)現(xiàn)輔酶再生進(jìn)而加速反應(yīng)進(jìn)行。EbSDR8和PpYSDR的最適反應(yīng)溫度分別為35℃和30℃，最適反應(yīng)pH均為7.5;值得注意的是，EbSDR8能夠在較寬pH范圍(7.O～10.5)催化反應(yīng)進(jìn)行，具有良好的pH適應(yīng)性。另一方面，EbSDR8和PpYSDR重組大腸桿菌

6、全細(xì)胞能夠在無(wú)外源輔酶添加的體系中高效催化一系列潛手性酮的不對(duì)稱還原，但其立體選擇性相反，分別遵循anti-Prelog和Prelog規(guī)則;分子水平的分析表明，兩者底物結(jié)合口袋幾何構(gòu)型和大小的顯著差異是導(dǎo)致其立體選擇性不同的關(guān)鍵因素，底物結(jié)合口袋的幾何構(gòu)型決定了底物的結(jié)合模式和取向定位，而結(jié)合口袋大小則影響了底物分子的自由旋轉(zhuǎn)，兩者共同決定了酶的立體選擇性。
　　基于對(duì)EbSDR8和PpYSDR底物結(jié)合口袋幾何構(gòu)型和氨基酸殘基組成

7、的比較及分子對(duì)接結(jié)果的分析，制定了減小空間位阻并建立/消除分子間相互作用的酶立體選擇性調(diào)控策略。該策略的運(yùn)用成功將PpYSDR還原一系列鹵代苯乙酮的立體選擇性從遵循Prelog規(guī)則轉(zhuǎn)變?yōu)樽裱璦nti-Prelog規(guī)則，特別是突變體M85T/L136E和M85V/M187D還原3'，5'-雙（三氟甲基）苯乙酮以及M85T/W182V和M85V/L136V還原2，2，2-三氟苯乙酮的立體選擇性完全反轉(zhuǎn)，相應(yīng)anti-Prelog手性醇ee值

8、達(dá)95％以上。通過(guò)分子對(duì)接逆向分析發(fā)現(xiàn)，突變位點(diǎn)的引入確實(shí)有效地執(zhí)行了所設(shè)計(jì)的立體選擇性調(diào)控策略，空間位阻的變化以及芳香環(huán)和鹵素原子參與的分子間作用力在酶立體選擇性反轉(zhuǎn)的發(fā)生和穩(wěn)定中發(fā)揮了重要作用。利用理性設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)PpYSDR立體選擇性反轉(zhuǎn)不僅有助于加深對(duì)此類酶立體選擇性調(diào)控機(jī)制的理解，同時(shí)也拓寬了anti-Prelog立體選擇性生物催化劑的來(lái)源。
　　通過(guò)詳細(xì)分析潛手性酮與EbSDR8分子對(duì)接結(jié)果，選取可能影響EbSDR8催化活

9、性的氨基酸殘基作為突變位點(diǎn)，并根據(jù)所選位點(diǎn)的氨基酸殘基性質(zhì)、與底物間的相互作用和對(duì)底物結(jié)合口袋構(gòu)型的影響等，有針對(duì)性地設(shè)計(jì)了一系列突變體。所設(shè)計(jì)的單點(diǎn)突變G94A和S153L分別提高了EbSDR8的催化活性，且這兩個(gè)位點(diǎn)的突變對(duì)催化活性的提高表現(xiàn)出明顯的協(xié)同效應(yīng)，其組合突變G94A/S153L還原潛手性酮的催化效率顯著提高，特別是其還原苯乙酮和4'-甲氧基苯乙酮的催化效率均達(dá)到野生型EbSDR8的15倍以上。分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬結(jié)果表明