幾株基因工程鏈霉菌的構建.pdf

1、鏈霉菌是重要的抗生素生產(chǎn)菌,其代謝過程的深入研究可以從基因水平解釋體內(nèi)代謝物變化,以及對目標代謝產(chǎn)物的影響,從而為工業(yè)生產(chǎn)菌株的分子水平優(yōu)化提供方向。
　　 乙酸是鏈霉菌無氧代謝的末端產(chǎn)物,乙酸累積抑制菌體生長和外源蛋白的表達。乙酰-CoA是某些次級代謝產(chǎn)物的重要前體,在理論上阻斷乙酰-CoA生成乙酸的途徑有可能促進菌體生長,同時增加目標產(chǎn)物的產(chǎn)量。敲除糖酵解途徑中的關鍵限速酶磷酸果糖激酶主要合成基因來使碳代謝流從糖酵解途徑轉移

2、到磷酸戊糖途徑,可研究兩條代謝途徑對葡萄糖代謝的影響,以及不同代謝途徑的中間產(chǎn)物對次級代謝物質合成的作用,對初級代謝的進一步研究有指導意義。透明顫菌血紅蛋白所具備的捕捉和釋放氧氣的能力使之在宿主細胞發(fā)酵時可以更好地滿足宿主細胞氧氣的需求。在鏈霉菌中表達透明顫菌血紅蛋白,能夠改善鏈霉菌對高氧的需要,促進體內(nèi)代謝,在理論上可能提高發(fā)酵過程中目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。
　　 本文利用RED敲除原理分兩步敲除鏈霉菌乙酸代謝途徑關鍵酶pta-ack

3、A基因和磷酸果糖激酶基因pfkA1。通過同源對比,擴增出關鍵酶基因。通過PCR、酶切、連接將其克隆到cosmid載體上,構建中間質粒。將質粒轉化到大腸桿菌BW25113／pIJ790體內(nèi),然后將安普抗性標記片斷目標基因置換,構建出敲除載體。通過原生質體轉化方式,導入利迪鏈霉菌。并通過松弛培養(yǎng),篩選得到鏈霉菌pta-ackA缺失菌株AS01和pfkA1缺失菌株AS02。
　　 根據(jù)透明顫菌血紅蛋白基因vgb堿基序列和鏈霉菌基因密碼