基因工程——重點(diǎn)

1、基因工程大綱基因工程大綱——高國(guó)輝老師部分高國(guó)輝老師部分名解：1、第一代基因工程（重組DNA）：是指重組DNA技術(shù)的產(chǎn)業(yè)化設(shè)計(jì)與應(yīng)用，包括上游技術(shù)和下游技術(shù)兩大組成部分。上游技術(shù)指的是基因重組、克隆和表達(dá)的設(shè)計(jì)與構(gòu)建（即重組DNA技術(shù)）；而下游技術(shù)則是涉及到基因工程菌或細(xì)胞的大規(guī)模培養(yǎng)以及基因產(chǎn)物的分離純化過(guò)程。2、第二代基因工程（蛋白質(zhì)工程）：研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，然后人為地設(shè)計(jì)一個(gè)新蛋白質(zhì)，并按這個(gè)設(shè)計(jì)的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)去改

2、變其基因結(jié)構(gòu)，從而產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)或者從蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系出發(fā)，定向地改造天然蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，特別是對(duì)功能基因的修飾，也可以制造新型的蛋白質(zhì)。3、第三代基因工程（途徑工程）：是多基因的基因工程。通過(guò)基因工程的手段來(lái)改變分叉代謝途徑的流向或阻斷有害代謝產(chǎn)物的合成等原理，來(lái)改變微生物代謝的流向，增加某些產(chǎn)物的產(chǎn)量，也可通過(guò)引入外源基因來(lái)延伸原來(lái)的代謝途徑，產(chǎn)生新的末端代謝產(chǎn)物，或者利用新底物作為生物合成的原料，也可以通過(guò)構(gòu)建新的代謝途徑合成

3、具有新化學(xué)結(jié)構(gòu)的代謝產(chǎn)物。4、質(zhì)粒：是生物細(xì)胞內(nèi)固有的、能獨(dú)立于寄主染色體而自主復(fù)制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子。5、考斯質(zhì)粒（cos）：是一類人工構(gòu)建的含有λDNAcos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的載體。6、克隆質(zhì)粒：常用于克隆和擴(kuò)增外源基因。它們或者含有氯霉素可擴(kuò)增的松弛型復(fù)制子的結(jié)構(gòu)，或者復(fù)制子經(jīng)過(guò)人工誘變，解除對(duì)質(zhì)?？截悢?shù)的負(fù)控制作用，使得質(zhì)粒在每個(gè)細(xì)胞中可達(dá)數(shù)千個(gè)復(fù)制拷貝。7、穿梭質(zhì)粒：這類質(zhì)粒分子上含有兩個(gè)親緣關(guān)系不同的復(fù)制

4、子結(jié)構(gòu)以及相應(yīng)的選擇性標(biāo)記基因，可以在兩種不同種屬的受體細(xì)胞中復(fù)制并檢測(cè)。8、表達(dá)質(zhì)粒：這類質(zhì)粒在多克隆位點(diǎn)的上游和下游分別裝有兩套轉(zhuǎn)錄效率較高的啟動(dòng)子，合適的核糖體結(jié)合位點(diǎn)（SD序列）以及強(qiáng)有力的終止子結(jié)構(gòu)，使得克隆在合適位點(diǎn)上的任何外源基因均能在受體細(xì)胞中高效的表達(dá)。9、限制性核酸內(nèi)切酶：生物體內(nèi)能識(shí)別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內(nèi)切核酸酶。它是可以將外來(lái)的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對(duì)自己的DN

5、A卻無(wú)損害作用，這樣可以保護(hù)細(xì)胞原有的遺傳信息。10、Klenow酶：用枯草芽孢桿菌蛋白酶處理切掉大腸桿菌DNA聚合酶ⅠN端的5→3外切酶活性部分。11、T4DNA連接酶：由T4噬菌體基因編碼，相對(duì)分子質(zhì)量為60KD?？梢杂脕?lái)修復(fù)DNA雙鏈上的單鏈缺口，連接RNADNA雜交雙鏈上的DNA鏈缺口或RNA鏈缺口，也可以用來(lái)連接完全斷開的兩個(gè)平頭雙鏈DNA分子。12、動(dòng)物的轉(zhuǎn)基因技術(shù)：利用轉(zhuǎn)基因的重組子構(gòu)建技術(shù)，重組分子導(dǎo)入動(dòng)物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化技術(shù)

6、，轉(zhuǎn)基因在受體細(xì)胞染色體上的穩(wěn)定整合及可控制性表達(dá)技術(shù)統(tǒng)稱為轉(zhuǎn)基因技術(shù)。13、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物：指以實(shí)驗(yàn)方法導(dǎo)入外源基因，在染色體組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。11、共抑制效應(yīng)：當(dāng)受體細(xì)胞染色體上含有轉(zhuǎn)基因的同源伙伴時(shí)，轉(zhuǎn)基因與內(nèi)源性同源基因的表達(dá)將同時(shí)受到抑制。12、基因治療：是指將外源正常基因?qū)氚屑?xì)胞，以糾正或補(bǔ)償因基因缺陷和異常引起的疾病，以達(dá)到治療目的。也就是將外源基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)將其插入病人的適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中，使外源基

7、因制造的產(chǎn)物能治療某種疾病。13、Ti的共整合轉(zhuǎn)化：TDNA在大腸桿菌質(zhì)粒上，含有E.coli的選擇標(biāo)記和植物選擇標(biāo)記Kmr。首先在E.coli中篩選重組分子，然后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中，質(zhì)粒與Ti質(zhì)粒上的同源序列發(fā)生同源重組，將外源基因整合到Ti質(zhì)粒上，用于侵染植物細(xì)胞。TDNA重組分子整合到植物細(xì)胞染色體DNA上，Kmr篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞。14、Ti質(zhì)粒的二元整合轉(zhuǎn)化系統(tǒng):即穿梭質(zhì)粒。插入外源基因的重組穿梭質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)化含有Ti質(zhì)粒的根瘤

8、農(nóng)桿菌，經(jīng)篩選后直接感染植物細(xì)胞。農(nóng)桿菌侵染植物細(xì)胞后，植物的創(chuàng)傷信號(hào)啟動(dòng)Ti質(zhì)粒上的Vir基因，隨后將穿梭質(zhì)粒的TDNA切割下來(lái)，轉(zhuǎn)移到植物細(xì)胞中。（與共整合系統(tǒng)所不同的是，含外源基因的質(zhì)?？稍谵r(nóng)桿菌內(nèi)自主復(fù)制并保留下來(lái)。）反式作用因子：具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)作用的蛋白因子。RNA聚合酶。特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子：激活蛋白或阻遏蛋白等。（2）影響轉(zhuǎn)錄的因素：?jiǎn)?dòng)子——起始部位：1、結(jié)合部位：10、識(shí)別部位：35；○1啟動(dòng)子決定轉(zhuǎn)錄方向及模板鏈；啟

9、動(dòng)子序列決定啟動(dòng)效率，不同的啟動(dòng)子序列對(duì)RNA聚合酶親和力不同，因此具有不同的起始頻率；σ因子與啟動(dòng)子序列特異性識(shí)別：○2原核生物只有一種RNA聚合酶，但具有多種σ因子，不同的起始因子選擇性識(shí)別不同的啟動(dòng)子。阻遏蛋白——在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)基因表達(dá)產(chǎn)生抑制作用的蛋白質(zhì)：負(fù)調(diào)控?！?由調(diào)控基因(i基因)編碼，阻遏蛋白是DNA結(jié)合蛋白，特異性識(shí)別并結(jié)合操縱子，阻止轉(zhuǎn)錄。信號(hào)分子＋阻遏蛋白——變構(gòu)——結(jié)合DNA（或去結(jié)合），從而誘導(dǎo)阻遏和誘導(dǎo)去阻遏。

10、正調(diào)控蛋白——結(jié)合于特異DNA序列后能促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄：正調(diào)控?！?CAP蛋白：分解代謝物基因活化蛋白又稱cAMP受體蛋白CRP。ntrC蛋白的調(diào)控。倒位蛋白——位點(diǎn)特異性重組酶?！?RNA聚合酶抑制物——細(xì)菌處于氨基酸饑餓狀態(tài)時(shí)RNA聚合酶活性下降，rRNA和tRNA合成減少或○6停止的現(xiàn)象稱為嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)。衰減子——位于操縱子第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之前，能夠減弱轉(zhuǎn)錄作用的序列。○7（3）基因表達(dá)調(diào)控的特點(diǎn)：基因表達(dá)調(diào)控具有時(shí)空兩重性：○1按功能需要

11、，某一特定基因表達(dá)的先后次序及相對(duì)強(qiáng)弱嚴(yán)格受時(shí)間的控制，稱為基因表達(dá)的時(shí)間特異性；某種基因產(chǎn)物在個(gè)體生長(zhǎng)過(guò)程中按不同組織、細(xì)胞乃至細(xì)胞器的空間順序出現(xiàn)，稱為基因表達(dá)的空間特異性。基因表達(dá)調(diào)控的模式復(fù)雜性：○2基因表達(dá)調(diào)控環(huán)節(jié)眾多，其中轉(zhuǎn)錄調(diào)控是關(guān)鍵.真核生物與原核生物相比的基因表達(dá)調(diào)控范圍要大?；虮磉_(dá)調(diào)控元件可分為核酸和蛋白質(zhì)兩大類?；虮磉_(dá)調(diào)控實(shí)質(zhì)是兩者之間的相互作用，包括核酸分子內(nèi)或分子間的相互作用、核酸和蛋白質(zhì)之間的相互作用、蛋

12、白分子內(nèi)或分子間的相互作用?；虮磉_(dá)調(diào)控的生物學(xué)意義：○3適應(yīng)環(huán)境，維持生長(zhǎng)和增殖、維持個(gè)體發(fā)育與分化、調(diào)控程序上的缺陷或紊亂將導(dǎo)致嚴(yán)重后果；（4）啟動(dòng)子的調(diào)控模型：?jiǎn)?dòng)子的一般特性：RNA聚合酶結(jié)合并啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的特異DNA序列。有序列特異性、方向特異性、位置特異性、種屬特異性。真核生物的啟動(dòng)子：根據(jù)所對(duì)應(yīng)的基因編碼產(chǎn)物分為：Ⅰ型啟動(dòng)子（rRNA基因）：核心啟動(dòng)子：緊鄰轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，足以使轉(zhuǎn)錄起始。上游控制元件（UCE）：180至107處