天藍(lán)鏈霉菌抗生素次生代謝調(diào)控的基因工程研究.pdf

1、該論文研究了天藍(lán)鏈霉菌(Streptomyces coelicolor)基因組DNA中抗生素代謝途徑專一調(diào)控基因、雙組分信號傳導(dǎo)基因及A因子調(diào)節(jié)體系關(guān)聯(lián)基因?qū)κ煌榛`菌紅素(Red)與放線菌紫素(Act)生物合成的影響;分析了這些基因?qū)股卮紊x過程的調(diào)控作用,通過將調(diào)控基因和螢光蛋白基因融合表達(dá),觀察了基因的時(shí)空表達(dá)模式.同時(shí),還成功地建立了三片段DNA和載體質(zhì)粒一次性連接的4-way ligation技術(shù)并分析討論了影響連接的

2、主要因素,考察了同源雙交換基因敲除進(jìn)行基因定位突變的影響因素,建立了有效的突變株篩選方法.根據(jù)天藍(lán)鏈霉菌基因組DNA中抗生素十一烷基靈菌紅素(Red)與放線菌紫素(Act)生物合成途徑專一調(diào)控基因分別是actⅡ-orf4和redD的報(bào)道,以整合型質(zhì)粒pSET1152為載體,將外源actⅡ-orf4和redD基因插入到天藍(lán)鏈霉菌的基因組DNA上,分別獲得了含雙拷貝actⅡ-orf4和redD的基因突變株lyqAG1521和lyqRY152

3、2.基因突變株的發(fā)酵動力學(xué)研究表明,lyqAG1521合成Act及l(fā)yqRY1522合成Red的能力分別提高了約40％,證實(shí)了actⅡ-orf4和redD拷貝數(shù)的增加有利于抗生素的生物合成,說明它們屬于正調(diào)控基因.采用同源雙交換技術(shù)分別敲除了天藍(lán)鏈霉菌染色體DNA中兩組雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因ecrA1/ecrA2和ecrE/ecrF,獲得了四個基因突變株lyqA2001、lyqA2002、lyqE2003和lyqF2004.發(fā)酵動力學(xué)試驗(yàn)表

4、明,四個基因突變株合成抗生素Red的能力顯著降低,而Act的生物合成水平只是略有降低,說明ecrA1/ecrA2和ecrE/ecrF對Red生物合成起強(qiáng)正調(diào)控作用,而對Act的生物合成只起到弱正調(diào)控作用.A因子SCB1是天藍(lán)鏈霉菌中的γ-丁內(nèi)酯類化合物,SCB1的生物合成與scbR和scbA兩個基因有關(guān),scbA是A因子合成酶基因、scbR編碼A因子的結(jié)合蛋白.采用同源雙交換技術(shù)分別敲除了scbR和scbA基因,篩選得到了基因敲除突變株