副溶血弧菌噬菌體VPp1內(nèi)溶素基因預(yù)測(cè)表達(dá)及其抑菌活性初步研究.pdf

1、副溶血弧菌是一種革蘭氏陰性菌，可導(dǎo)致人畜共患病，廣泛的存在于海洋環(huán)境及各種海產(chǎn)品中，包括海水沉積物、魚(yú)、蝦、貝類(lèi)等。副溶血弧菌被認(rèn)為是海水養(yǎng)殖動(dòng)物的條件致病菌，并且容易引發(fā)人類(lèi)大規(guī)模食物中毒，為了防控副溶血弧菌的危害，抗生素的大量使用導(dǎo)致弧菌耐藥性增強(qiáng)，新型抗菌素的需求已經(jīng)迫在眉睫。噬菌體及其編碼的內(nèi)溶素是細(xì)菌的自然天敵，可以專(zhuān)一、快速、高效的裂解細(xì)菌，內(nèi)溶素又被稱(chēng)為21世紀(jì)最有前景的酶類(lèi)抗生素之一。
　　本研究以副溶血弧菌噬菌體

2、為研究對(duì)象，通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的多株副溶血弧菌噬菌體進(jìn)行初步篩選，從中篩選出一株優(yōu)勢(shì)噬菌體VPp1，通過(guò)對(duì)噬菌體VPp1功能基因組學(xué)分析，從生物信息學(xué)的角度詮釋噬菌體VPp1對(duì)副溶血弧菌的裂解機(jī)制，并推定出編碼內(nèi)溶素基因，利用基因工程技術(shù)對(duì)內(nèi)溶素基因進(jìn)行克隆和表達(dá)，利用物理化學(xué)方法對(duì)重組內(nèi)溶素LysVPp1生物學(xué)活性進(jìn)行驗(yàn)證。
　　1.對(duì)14株副溶血弧菌噬菌體進(jìn)行初步的篩選，通過(guò)增殖獲得高效價(jià)噬菌體、限制性?xún)?nèi)切酶HindⅢ進(jìn)行酶切，

3、并對(duì)裂解譜進(jìn)行了測(cè)定。研究中發(fā)現(xiàn)噬菌體VPp1增殖后可以獲得較高的效價(jià)、酶切鑒定為一株新型噬菌體、裂解3種副溶血弧菌、裂解液最澄清，并且前期研究結(jié)果表明噬菌體VPp1在檢測(cè)牡蠣中副溶血弧菌和控制牡蠣中副溶血弧菌方面有較好的表現(xiàn)，最終選取副溶血弧菌噬菌體VPp1進(jìn)行后續(xù)研究。本實(shí)驗(yàn)室已完成副溶血弧菌噬菌體VPp1的全基因組測(cè)序及初步基因組信息注釋?zhuān)⒁言贕enBank上登錄(No.KJ936628)。
　　2.通過(guò)對(duì)副溶血弧菌噬菌體

4、VPp1全基因組分析，利用相似性比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST和序列模體數(shù)據(jù)庫(kù)，初步推定該基因組的ORF31編碼內(nèi)溶素，預(yù)測(cè)該開(kāi)放式閱讀框編碼一種糖苷水解酶。預(yù)測(cè)內(nèi)溶素等電點(diǎn)為4.58，質(zhì)量分?jǐn)?shù)28.2kDa，不含信號(hào)肽、跨膜區(qū)域，含有兩個(gè)疏水域、一個(gè)結(jié)構(gòu)域。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析顯示其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是無(wú)規(guī)則卷曲，三級(jí)結(jié)構(gòu)與溶菌酶結(jié)構(gòu)具有相似性。從生物信息學(xué)角度推定噬菌體VPp1內(nèi)溶素的裂解機(jī)制可能是聯(lián)合孔蛋白協(xié)同作用裂解細(xì)菌肽聚糖。
　　3.選取p

5、ET克隆表達(dá)系統(tǒng)的pET-28a表達(dá)載體，以Rosetta(DE3)為宿主菌進(jìn)行內(nèi)溶素的重組表達(dá)，在最佳的誘導(dǎo)時(shí)間4h、溫度37℃和IPTG濃度0.1mmol/L條件下，誘導(dǎo)表達(dá)生成可溶性重組內(nèi)溶素LysVPp1;SDS-PAGE檢測(cè)重組內(nèi)溶素分子質(zhì)量大小約為40kDa;通過(guò)非變性Ni2+親和層析柱純化，10kDa截留超濾離心管除鹽和濃縮，最終獲得蛋白濃度為1mg/mL的重組內(nèi)溶素LysVPp1，于-20℃保存。
　　4.對(duì)重組內(nèi)

6、溶素LysVPp1的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行探究，測(cè)得其對(duì)細(xì)菌肽聚糖、死細(xì)菌和活菌均有較強(qiáng)裂解能力;LysVPp1作用條件較溫和，pH5-8時(shí)可保持較好的活性，55℃條件下30min仍能保持60％以上的活性，-20℃條件下保存半年仍有80％以上的活性。此外，低濃度Zn2+和Ca2+可以明顯提高LysVPp1活性。LysVPp1對(duì)15種副溶血弧菌中的9種顯示出裂解性，裂解譜比噬菌體VPp1裂解譜更寬。LysVPp1的特性表明其具有成為新型酶類(lèi)抗生素的

7、潛力。
　　綜上所述，本研究首先通過(guò)噬菌體篩選得到優(yōu)勢(shì)噬菌體VPp1，序列與結(jié)構(gòu)分析提示副溶血弧菌噬菌體VPp1內(nèi)溶素可能是一種糖苷水解酶;對(duì)VPp1內(nèi)溶素基因進(jìn)行克隆和誘導(dǎo)表達(dá)，利用非變性的Ni-NTA柱親和層析和超濾濃縮，獲得純化的重組內(nèi)溶素LysVPp1;獲得的LysVPp1經(jīng)體外活性檢測(cè)證實(shí)，對(duì)副溶血弧菌細(xì)胞壁肽聚糖具有降解活性，并且對(duì)EDTA處理后死菌和活菌均有裂解活性。本研究豐富了噬菌體基因組注釋信息，填補(bǔ)了副溶血弧菌