摩氏摩根菌噬菌體MmP1內(nèi)溶素基因預(yù)測(cè)、克隆、表達(dá)及生物學(xué)活性的初步研究.pdf

1、摩氏摩根菌是革蘭陰性菌,屬腸桿菌科,有3個(gè)亞種,M.morganii、M.sibonii.和Morganella psychrotolerans,存在于環(huán)境中,以及人類、爬行動(dòng)物和哺乳動(dòng)物的腸道內(nèi)。摩氏摩根菌是引發(fā)院內(nèi)感染的重要病原菌之一。噬菌體作為細(xì)菌的病毒,是微生物中的非細(xì)胞形態(tài)的低級(jí)生命形式,它在自然界中廣泛存在,是生物圈中數(shù)量最多的生命形式。本實(shí)驗(yàn)室已完成摩氏摩根菌噬菌體MmP1的全基因組測(cè)序及初步的基因組注釋,并已在GenBa

2、nk上登錄(No.EU652770)。
　　 噬菌體是以細(xì)菌為宿主的病毒,能夠特異性的感染和裂解細(xì)菌。噬菌體感染宿主菌時(shí),要穿過(guò)細(xì)菌細(xì)胞壁肽聚糖層,或者將其核酸注入到宿主菌體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制。而噬菌體完成復(fù)制、組裝后,又需破壞宿主菌肽聚糖層,釋放子代噬菌體,進(jìn)行下一步的感染。而控制雙鏈DNA噬菌體進(jìn)入宿主細(xì)胞的物質(zhì)是一種由噬菌體編碼的蛋白,稱作內(nèi)溶素或溶素(Endolysin or Lysin)。內(nèi)溶素是一種可以破壞宿主菌細(xì)胞壁肽聚糖

3、的酶蛋白。因此,在對(duì)抗生素耐藥性越來(lái)越明顯的情況下,內(nèi)溶素有可能成為某些致病細(xì)菌的潛在抗感染藥物。
　　 通過(guò)基因預(yù)測(cè)及BLAST分析,我們推定摩氏摩根菌噬菌體MmP1基因組的ORF12編碼內(nèi)溶素基因。因此本文首先從生物信息學(xué)的角度對(duì)該基因編碼產(chǎn)物的氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析,隨即克隆MmP1內(nèi)溶素基因,并成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒,然后表達(dá)、純化得到重組蛋白,進(jìn)一步分析重組蛋白對(duì)底物肽聚糖的降解活性及抑菌作用,通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了內(nèi)溶素的基本生

4、物學(xué)活性。其研究?jī)?nèi)容和結(jié)果主要有以下幾個(gè)方面:
　　 1.摩氏摩根菌噬菌體MmP1內(nèi)溶素氨基酸序列與結(jié)構(gòu)的分析:通過(guò)BLAST檢索獲得推定的摩氏摩根菌噬菌體MmP1內(nèi)溶素的同源蛋白,分子系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化分析提示摩氏摩根菌噬菌體MmP1內(nèi)溶素與噬菌體K11溶菌酶的進(jìn)化距離最近,二者可能來(lái)源于同一祖先序列;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示MmP1內(nèi)溶素具有與T7酰胺酶相似的二級(jí)結(jié)構(gòu)與三級(jí)結(jié)構(gòu),并含有由。Hisl7、Tyr46、His122、Lys

5、128及Cys130構(gòu)成的活性中心,該結(jié)果提示MmP1.內(nèi)溶素可能為一種具有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性的鋅酰胺酶。
　　 2.摩氏摩根菌噬菌體MmP1內(nèi)溶素全長(zhǎng)基因的克隆:通過(guò)對(duì)PCR反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化,擴(kuò)增到了內(nèi)溶素全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)基因,并將其插入原核表達(dá)載體pQE31中,成功構(gòu)建了內(nèi)溶素重組質(zhì)粒pQE31-M12。該重組質(zhì)粒經(jīng)BamHⅠ和salⅠ雙酶切鑒定后,對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行核苷酸測(cè)序,結(jié)果表明重組質(zhì)粒的序列和閱讀框均正確

6、。
　　 3.摩氏摩根菌噬菌體MmP1內(nèi)溶素全長(zhǎng)基因的表達(dá)與純化:將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌JM109,獲得了表達(dá)穩(wěn)定的基因工程菌,并優(yōu)化了表達(dá)條件。該表達(dá)菌經(jīng)過(guò)超聲裂解及SDS-PAGE電泳,確定目的蛋白為分泌型表達(dá),故對(duì)融合蛋白上清行非變性的Ni-NTA柱親和層析以及分子篩層析純化后,獲得單一條帶的目的蛋白。Lowry法測(cè)定目標(biāo)蛋白濃度為4.964 mg/ml。
　　 4.重組融合蛋白的降解活性測(cè)定:提取摩氏摩根菌細(xì)胞

7、肽聚糖成分,采用酶譜電泳法、擴(kuò)散法檢測(cè)重組融合蛋白(濃度為10mg/ml)對(duì)細(xì)胞壁肽聚糖層的降解活性,結(jié)果顯示重組融合蛋白對(duì)摩氏摩根菌肽聚糖具有顯著降解作用。
　　 5.重組融合蛋白抑菌活性研究:通過(guò)擴(kuò)散法,利用重組融合蛋白(濃度為20mg/ml)分別處理革蘭陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)和革蘭陰性菌(銅綠假單胞菌和摩氏摩根菌),結(jié)果顯示目的蛋白只對(duì)金黃色葡萄球菌具有抑制現(xiàn)象,而對(duì)革蘭陰性菌沒(méi)有抑制現(xiàn)象;進(jìn)一步測(cè)得重組融合蛋白的MIC

8、值為0.39gg/ml,并將其與三種抗生素(新青Ⅱ、Amp、Car)協(xié)同作用,結(jié)果提示重組融合蛋白可顯著增強(qiáng)這三種抗生素對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性。
　　 綜上所述,本研究首先通過(guò)序列與結(jié)構(gòu)分析提示摩氏摩根菌噬菌體MmP1內(nèi)溶素可能為一種具有N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶活性的鋅酰胺酶;然后對(duì)MmP1內(nèi)溶素基因進(jìn)行了克隆和表達(dá),并通過(guò)非變性的Ni-NTA柱親和層析以及分子篩層析,獲得了純化的重組融合蛋白;獲得的融合蛋白經(jīng)體外活