用于脊髓修復(fù)的絲素基定向多通道支架的研究.pdf

1、脊髓損傷是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的一種嚴(yán)重?fù)p傷，我國每年因高空墜落、交通事故等造成的嚴(yán)重脊髓損傷病例至少數(shù)萬例，而脊髓損傷的修復(fù)和重建一直是再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題和研究熱點(diǎn)之一。目前，自體神經(jīng)移植仍然是嚴(yán)重脊髓缺損修復(fù)的主要手段。為了替代自體神經(jīng)移植物，減少供體不足和結(jié)構(gòu)差異的限制以及二次手術(shù)的痛苦，恢復(fù)脊髓的正常結(jié)構(gòu)和功能，迫切需要研制既具備促脊髓修復(fù)活性，又具有良好的生物相容性，且結(jié)構(gòu)可調(diào)控的新型脊髓修復(fù)支架。國內(nèi)外的研究已初步證明絲素蛋白(SF

2、)用于修復(fù)神經(jīng)組織缺損具有一定的優(yōu)勢(shì)。若能進(jìn)一步增強(qiáng)支架調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的能力，并提高其引導(dǎo)細(xì)胞和組織生長(zhǎng)的模板功能，則其有可能滿足脊髓損傷修復(fù)的需要。本文采用定向溫度場(chǎng)冷凍-干燥技術(shù)制備具有定向通道的SF支架，研究制備條件對(duì)支架結(jié)構(gòu)和性能的影響，探討孔道的形成機(jī)制；在SF基定向多通道支架上原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，研究定向通道支架的結(jié)構(gòu)對(duì)神經(jīng)元行為的影響；并通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，研究SF基定向多通道支架植入后，促進(jìn)脊髓缺損修復(fù)的活性及其機(jī)制。
　

3、　 首先，采用定向溫度場(chǎng)冷凍使冰晶定向生長(zhǎng)，經(jīng)冷凍干燥、冰晶升華后制備出具有定向孔道的多孔SF支架，定向通道的內(nèi)表面存在大量的“脊”。支架具有良好吸水性能和孔的連通性，其孔徑隨著冷凍溫度的降低和SF溶液濃度的增大而減小，平均孔徑為40.29-238.49μm，孔隙率為54.29-93.13％。定向溫度場(chǎng)冷凍過程中，冰晶的定向生長(zhǎng)對(duì)SF分子鏈段產(chǎn)生應(yīng)力作用，同時(shí)SF溶液被濃縮，SF分子鏈段聚集、結(jié)晶，使支架內(nèi)β-sheet結(jié)構(gòu)的含量增大

4、。改變絲素溶液中的化學(xué)勢(shì)分布，可以達(dá)到改變冰核或冰晶的尺寸、控制三維支架內(nèi)平行排列的孔道的直徑和形狀的目的。
　　 其次，在定向多通道SF支架表面引入層粘連蛋白(LN)，體外原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元的結(jié)果表明，神經(jīng)元能夠以SF支架為載體生長(zhǎng)，并能正常表達(dá)神經(jīng)元的標(biāo)記性蛋白神經(jīng)絲(NF200)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP43)、微管相關(guān)蛋白(MAP2)和β-Ⅲ-tubulin，幾乎不表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)。神經(jīng)元多粘附在定向通道

5、的孔壁上，軸突沿孔道的方向延伸。進(jìn)一步研究表明，定向多通道SF支架孔道內(nèi)表面的“脊”對(duì)神經(jīng)元具有引導(dǎo)作用，有利于神經(jīng)元的粘附、遷移和軸突的延伸。
　　 再次，將非定向SF支架、定向多通道SF支架和改性后的定向多通道SF支架三種材料植入SD大鼠背部正中T8-T10處脊髓半缺損部位，進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)，結(jié)果顯示三種材料內(nèi)均無明顯的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，材料引起的機(jī)體免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)輕微。組織修復(fù)細(xì)胞均能遷移進(jìn)入材料內(nèi)部構(gòu)建脊髓組織。改性后的定向

6、多通道SF支架中，再生軸突能夠貫穿缺損區(qū)域到達(dá)遠(yuǎn)端實(shí)現(xiàn)橋接，且定向多通道支架中的毛細(xì)血管更豐富，新生組織和正常脊髓組織更接近。BBB功能恢復(fù)評(píng)分結(jié)果顯示，定向多通道支架組得分明顯高于非定向組，有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 最后，采用多個(gè)因子免疫組化的方法探究定向SF支架促進(jìn)脊髓修復(fù)的機(jī)制，定向多通道支架組內(nèi)GAP43、NF、神經(jīng)元特異性烯酸化酶(NSE)和β-Ⅲ-tubulin的陽性表達(dá)率高于非定向材料組，而GFAP的表

7、達(dá)量低于對(duì)照組，均有顯著性差異(P＜0.05)。這進(jìn)一步說明SF基定向多通道支架具有促進(jìn)脊髓損傷處軸突的再生、減輕瘢痕和利于脊髓重建的活性，同時(shí)也提示產(chǎn)生這一活性的機(jī)制是支架通過吸附體液中的活性成分和炎性細(xì)胞等，形成有利于細(xì)胞生長(zhǎng)的微環(huán)境。細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子并富集在支架內(nèi)，趨化神經(jīng)細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞向材料內(nèi)遷移，并通過支架定向通道的模板作用引導(dǎo)軸突的延伸和新生組織的形成，最終實(shí)現(xiàn)脊髓修復(fù)。
　　 通過本