絲素材料表面微-納米形貌對(duì)細(xì)胞及脊髓修復(fù)的引導(dǎo)作用.pdf

1、脊髓損傷修復(fù)是組織工程領(lǐng)域的一個(gè)富有挑戰(zhàn)性的課題。利用生物材料的表面微圖案化技術(shù)調(diào)控細(xì)胞的行為，構(gòu)建具有微/納米定向引導(dǎo)功能的支架，引導(dǎo)軸突的再生，是促進(jìn)脊髓損傷修復(fù)的可能途徑。而實(shí)現(xiàn)這一構(gòu)想的前提是進(jìn)一步認(rèn)識(shí)細(xì)胞對(duì)材料表面微/納米結(jié)構(gòu)形貌的響應(yīng)機(jī)制，充分認(rèn)識(shí)其響應(yīng)規(guī)律。本文以絲素生物材料為基礎(chǔ)，從二維平面的絲素材料出發(fā)，探索絲素膜材料表面微/納米拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的細(xì)胞響應(yīng)行為并得出基本規(guī)律，繼而將其應(yīng)用絲素三維支架材料的制備，通過(guò)在三維支架中

2、引入微/納米引導(dǎo)信號(hào)和生物活性信號(hào)以促進(jìn)脊髓損傷后的軸突再生。
　　首先，通過(guò)聚二甲基硅氧烷（PDMS）模板制備了帶有微球陣列圖案和微柱陣列結(jié)構(gòu)的絲素膜，研究了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）對(duì)微形貌的響應(yīng)行為。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，絲素膜表面的微球陣列圖案有利于細(xì)胞黏附和增殖，而仿荷葉結(jié)構(gòu)的微柱結(jié)構(gòu)則不利于細(xì)胞的黏附、鋪展和增殖。在細(xì)胞黏附和鋪展過(guò)程中，偽足的轉(zhuǎn)變起著關(guān)鍵作用，細(xì)胞能夠沿著錨定的絲狀偽足形成小片狀偽足引導(dǎo)片狀偽足延伸，最終控制

3、細(xì)胞鋪展和遷移方向。另一方面，本文在觀察BMSCs在微柱陣列結(jié)構(gòu)表面的生長(zhǎng)情況時(shí)，意外發(fā)現(xiàn)了微柱結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞間隧道納米管（TNTs）的延伸具有明顯的影響。TNTs能夠和微柱表面發(fā)生相互作用，微柱結(jié)構(gòu)能夠?yàn)門(mén)NTs的延伸提供支撐。同時(shí)，微柱結(jié)構(gòu)也明顯影響了TNTs的延伸方向，相鄰的細(xì)胞間TNTs并沒(méi)有以最近的距離形成直線連接，而是能夠繞過(guò)微柱連接到相鄰細(xì)胞。結(jié)果提示，材料的表面拓?fù)湫蚊部赡苡绊慣NTs連接的細(xì)胞間通訊。
　　其次，利用

4、PDMS模板和靜電紡技術(shù)制備了具有溝槽圖案和定向微/納米纖維涂層的絲素膜，研究了取向圖案對(duì)BMSCs的定向引導(dǎo)作用。結(jié)果顯示，絲素微/納米纖維結(jié)構(gòu)明顯有利于細(xì)胞的黏附和增殖。在細(xì)胞定向伸展過(guò)程中，絲狀偽足識(shí)別基底形貌并引導(dǎo)片狀偽足在取向圖案表面的定向延伸，表明絲狀偽足引導(dǎo)的片狀偽足極化在接觸引導(dǎo)過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。
　　再次，為了引導(dǎo)和促進(jìn)軸突再生，制備了層粘連蛋白（LN）修飾的定向絲素微/納米纖維網(wǎng)。通過(guò)調(diào)節(jié)滾軸轉(zhuǎn)速獲得了定向性

5、良好的絲素微/納米纖維網(wǎng)，在本文紡絲條件下，滾軸轉(zhuǎn)速達(dá)到2000r/min（相應(yīng)的表面線速度為10.47m/s）時(shí)，纖維定向和沉積良好。EDC活化成功地將LN固定到絲素纖維表面，提高了絲素微/納米纖維的生物活性。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，LN修飾的定向絲素微/納米纖維能夠促進(jìn)和引導(dǎo) PC12神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)。
　　最后，用定向的絲素微/納米纖維構(gòu)建了多通道的導(dǎo)管，并用LN加以功能化修飾，用于大鼠脊髓損傷修復(fù)。導(dǎo)管內(nèi)部為一百微米到數(shù)百微米范圍內(nèi)的

6、從小到大的多級(jí)通道，且每個(gè)通道均具有定向的微/納米纖維引導(dǎo)信號(hào)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，導(dǎo)管的LN修飾和內(nèi)壁定向排列的纖維為軸突生長(zhǎng)提供了生物活性信號(hào)和物理引導(dǎo)信號(hào)。在大鼠脊髓半切除模型中，通過(guò)行為學(xué)評(píng)價(jià)、組織學(xué)觀察和免疫組化檢測(cè)研究了LN交聯(lián)的多通道導(dǎo)管對(duì)脊髓損傷的修復(fù)效果，并比較了多通道導(dǎo)管和單通道導(dǎo)管的促進(jìn)作用。結(jié)果顯示，兩種導(dǎo)管均能明顯減少瘢痕和空洞的形成，能夠引導(dǎo)組織長(zhǎng)入導(dǎo)管連接損傷遠(yuǎn)端。與單通道導(dǎo)管相比，多通道結(jié)構(gòu)增大了導(dǎo)管內(nèi)部比表面