Arresten蛋白的表達(dá)純化工藝及藥效學(xué)研究.pdf

1、目的：
　　 1.建立Arresten蛋白的JM109/pBV221/Arresten原核表達(dá)體系；
　　 2.研究Arresten蛋白的純化方法，建立Arresten蛋白的制備工藝；
　　 3.Arresten蛋白純品的藥效學(xué)研究。
　　 方法：
　　 1.內(nèi)源性血管生成抑制因子Arresten原核表達(dá)體系的建立
　　 從GenBank中獲取Arresten基因序列，設(shè)計引物，在其羧基端

2、加入六聯(lián)組氨酸標(biāo)簽。從健康產(chǎn)婦胎盤組織中提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄—聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)擴(kuò)增出Arresten基因，將基因克隆入pMD19-T載體中，測序確認(rèn)。經(jīng)限制性內(nèi)切酶EcoRI、Sal I雙酶切，將Arresten基因定向插入表達(dá)載體pBV221，轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109進(jìn)行溫控誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和免疫蛋白印跡技術(shù)(Western blotting)對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。
　　

3、 2.Arresten蛋白的純化
　　 超聲破菌，分離得到包涵體，在變性條件下采用金屬螯合親和層析(IMAC)方法純化Arresten蛋白。使用Ni2+NTA親和柱，通過pH洗脫和咪唑洗雜結(jié)合的方法，對洗脫緩沖液和洗雜緩沖液進(jìn)行優(yōu)選，探尋Arresten蛋白的最優(yōu)純化條件，用BCA法測定純化產(chǎn)物的蛋白含量，SDS-PAGE電泳檢測純化產(chǎn)物的純度，并進(jìn)一步對純化產(chǎn)物復(fù)性。
　　 3.Arresten蛋白的藥效學(xué)研究

4、>　　 (1)Arresten蛋白作用于體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)和人宮頸癌細(xì)胞(HeLa)：MTT法檢測Arresten蛋白對HUVEC和HeLa細(xì)胞增殖能力和黏附能力的影響；流式細(xì)胞儀分析Arresten蛋白作用下兩種細(xì)胞凋亡的情況；細(xì)胞侵襲試驗觀察Arresten蛋白對兩種細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　 (2)雞胚絨毛尿囊膜(CAM)實驗觀察Arresten蛋白對新生血管的抑制情況。
　　 (3)建立小

5、鼠移植瘤模型，隨機(jī)分組，治療組瘤體內(nèi)以3.2mg/kg劑量直接注射Arresten蛋白，對照組注射0.1ml生理鹽水，每2天一次，共10天。觀察瘤體大小變化、小鼠活動能力、飲食等狀況。10天治療后處死小鼠，摘取腫瘤，稱量瘤重，計算腫瘤體積(tumor volume,TV)、相對腫瘤體積(relative tumor volume,RTV)及相對腫瘤抑制率。利用CD31抗體染色免疫組化方法檢測腫瘤組織血管生成情況。
　　 結(jié)果：<

6、br>　　 1.測序結(jié)果和酶切鑒定證實Arresten基因正確地插入表達(dá)載體中。經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析，重組體Arresten在大腸桿菌JM109中獲得表達(dá)，分子量約為26000，表達(dá)量約占菌體總蛋白的30％。經(jīng)Western blotting檢測表明該異源重組蛋白具有添加的親和純化標(biāo)簽His-tag的抗原活性。成功構(gòu)建了有效的原核表達(dá)體系JM109/pBV221/Arresten。
　　 2.通

7、過對洗脫緩沖液和洗雜緩沖液的優(yōu)化研究，發(fā)現(xiàn)采用含有15mM咪唑的洗雜緩沖液洗滌雜蛋白，能有效減少雜質(zhì)蛋白的非特異性結(jié)合；調(diào)整洗脫緩沖液pH值為5.1，可使目的蛋白更好的洗脫下來。建立了最適宜于Arresten蛋白的純化方法，可以一步得到純度在97％以上的Arresten蛋白。
　　 3.濃度0.8μg/ml的Arresten蛋白能有效抑制HUVEC的增殖、侵襲(P＜0.01)，引起HUVEC的凋亡(P＜0.01)，并且在一定范圍

8、內(nèi)隨著Arresten蛋白濃度的增加，抑制作用與致凋亡作用明顯加強(qiáng)。Arresten蛋白對HeLa細(xì)胞基本沒有抑制增殖和致凋亡作用，有一定抑制HeLa細(xì)胞侵襲的效果(P＜0.05)，但沒有明顯的濃度依賴性。Arresten蛋白能明顯減少HUVEC與HeLa細(xì)胞之間的黏附(P＜0.01)，0.8μg/ml的Arresten蛋白對其黏附抑制率為42.7％，再增加Arresten蛋白濃度，抑制率基本不變。
　　 4.Arresten蛋

9、白能有效抑制雞胚尿囊膜血管的生長(P＜0.01)，特別對中小血管的抑制作用較為明顯。經(jīng)Arresten蛋白作用，血管數(shù)目明顯減少，血管輻輳低，以非特異性的雜亂、平行、貫穿等表現(xiàn)形式為主，出現(xiàn)血管細(xì)小稀疏、分支少、甚至血管斷裂、毛細(xì)血管消失等現(xiàn)象。
　　 5.Arresten蛋白注射治療組小鼠治療前后飲食、行為無明顯異常，反應(yīng)能力、營養(yǎng)狀況良好，Arresten蛋白在小鼠體內(nèi)未引起明顯免疫反應(yīng)。在治療第5天瘤體增長速度開始減慢，7

10、天后腫瘤體積開始縮小。而陰性對照組小鼠隨著時間延長，腫瘤呈進(jìn)行性生長，飲食、活動和反應(yīng)能力逐漸變差，后期呈惡病質(zhì)態(tài)。治療第10天Arresten蛋白組小鼠瘤重0.88±0.25g，瘤體積為765.19±249.41mm3，相對腫瘤體積為1.83±0.99，顯著低于陰性對照組(P＜0.01)。相對腫瘤抑制率為80.81％。經(jīng)CD31多克隆抗體檢測發(fā)現(xiàn)，治療組瘤組織內(nèi)血管形成明顯減少。
　　 結(jié)論：
　　 本研究應(yīng)用基因工程