基于納米金顆粒的高靈敏適配體傳感器的構(gòu)建及其在真菌毒素檢測中的應(yīng)用.pdf

1、真菌毒素是一類具有極強毒性的真菌次級代謝產(chǎn)物，廣泛存在于各類食物及飼料中，嚴(yán)重危害著人類和動物的生命安全與健康。目前，高效液相層析法和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析法在真菌毒素分析檢測中應(yīng)用最為廣泛，這兩種方法雖然具有很好的靈敏度和較低的最低檢出限(LOD)，但是需要昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的操作流程、專業(yè)的技術(shù)人員等，嚴(yán)重制約了它們在食品日常檢測中的應(yīng)用。為了獲得便捷高效、高靈敏度、高特異性、成本低廉的真菌毒素檢測技術(shù)，科研工作者們提出了多種解決

2、方案，其中包括應(yīng)用納米粒子對能夠識別待測毒素的抗體或是適配體進行標(biāo)記，通過多種檢測手段，實現(xiàn)對真菌毒素的檢測。然而現(xiàn)有的檢測方法很難滿足在保有一個較寬檢測范圍的同時，獲得一個極低的檢出限。
　　為應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，本課題設(shè)計開發(fā)了兩種基于納米金的適配體傳感器，通過優(yōu)化設(shè)計思路，充分發(fā)揮納米材料及核酸適配體所具備的特性，實現(xiàn)對真菌毒素的快速、靈敏、低成本的檢測。
　　本課題的主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　1．基于納米金構(gòu)建用

3、于AFB1檢測的適配體傳感器
　　納米金膠體在520nm左右有一特征吸收峰。本實驗通過將AFB1核酸適配體修飾于納米金表面來獲得探針。檢測時，預(yù)先將待測液與一定濃度的AFB1-BSA混合，然后將上述納米金探針加入該混合體系。若待測液中沒有AFB1，納米金表面的AFB1適配體則會與BSA上的AFB1特異性結(jié)合，由于一個BSA分子上標(biāo)記有多個AFB1，從而引發(fā)納米金聚沉現(xiàn)象，納米金在特征峰處吸收強度下降。反之，待測液中的游離AFB1會

4、與BSA-AFB1形成競爭，抑制納米金聚沉和特征吸收峰的降低。本體系中，根據(jù)納米金的特征峰吸收與待測AFB1濃度的相關(guān)性，實現(xiàn)對未知濃度的AFB1的檢測。線性檢測范圍為10 pg mL－1至1μg mL－1，最低檢測限為4.1 pg mL－1。
　　2．基于FRET現(xiàn)象構(gòu)建高靈敏OTA適配體傳感器
　　FRET適配體傳感器包括一個未經(jīng)修飾的OTA適配體作為識別探針，OTA適配體部分互補鏈修飾的金納米粒子（互補鏈末端修飾有生物

5、素，生物素-互補DN A-金納米粒子）作為能量受體，和一個經(jīng)Cy3標(biāo)記的鏈霉親和素作為能量供體。該適配體傳感器用于檢測OTA時，適配體與其互補鏈分離，與OTA特異性結(jié)合，修飾于互補鏈末端的生物素暴露于鏈霉親和素，通過生物素和鏈霉親和素之間的特異結(jié)合，Cy3匯集于納米金表面從而實現(xiàn)FRET。本體系中，隨著OTA濃度的逐漸增大，Cy3的發(fā)射光強度隨之下降。在優(yōu)化條件下，OTA的線性檢測范圍為2.5 pg mL－1至1μg mL－1，最低檢測

6、限可達(dá)1.4 pg mL－1。
　　3．核酸適配體傳感器的選擇性和特異性評價
　　我們將常見的FB1、DON作為干擾毒素，另將AFB1與OTA互為干擾毒素，分別加入檢測體系，評價上述兩種適配體傳感器對于非目標(biāo)物的特異性和選擇性。結(jié)果顯示，上述兩種適配體傳感器僅對目標(biāo)物表現(xiàn)出特異性響應(yīng)，表明它們均具有良好的選擇性和特異性。
　　4．選擇小麥提取物及綠咖啡提取物作為模擬樣品，評價OTA適配體傳感器在實際應(yīng)用中的潛力

7、　　為驗證OTA適配體傳感器是否能應(yīng)用于實際檢測中，我們分別提取了小麥與綠咖啡的浸取液，并向其中加入已知濃度的OTA標(biāo)準(zhǔn)品，然后用所開發(fā)的適配體傳感器對其進行檢測。實驗結(jié)果顯示：盡管在本模擬體系中所獲得的最低檢出限稍高于實驗室條件下所得到的最低檢出限，但仍然遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于國家標(biāo)準(zhǔn)所規(guī)定的最大容許濃度，證實了上述兩種傳感器在實際檢測中的應(yīng)用潛力和可行性。
　　綜上所述，本課題中我們充分發(fā)揮納米金和核酸適配體的特性，開發(fā)了兩種應(yīng)用于真菌毒素