蛋清卵類粘蛋白的分離純化純化、結(jié)構(gòu)表征及其過敏原性的研究.pdf

1、卵類粘蛋白的研究始于20世紀(jì)初，雖然到現(xiàn)在，其基本的結(jié)構(gòu)，性質(zhì)和特性已為人所知，但在抑制其過敏原性這一方面，一直都沒有簡單而有效的方法，本研究從蛋清中分離純化得到了卵類粘蛋白純品，并對(duì)其構(gòu)象及過敏原性進(jìn)行了研究，主要研究結(jié)果如下：
　　 本文采用TCA-丙酮法粗分離，以及DEAE-32精細(xì)純化的方法制備了卵類粘蛋白。SDS-PAGE法分析測(cè)定所得CHOM樣品純度約為95.3%。50 mL蛋清分離獲得CHOM樣品重為300 mg，

2、蛋清中蛋白含量為10%，CHOM占蛋清蛋白質(zhì)11%，計(jì)算可得CHOM回收率為23.8%。通過胰蛋白酶抑制性測(cè)得所得CHOM純品比活力高達(dá)7200 BAEE單位/mg CHOM，說明基本未變性。采用了紅外光譜法對(duì)CHOM構(gòu)象進(jìn)行表征，并計(jì)算得到其二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量，α-螺旋為26.7%，β-折疊為50%，β-轉(zhuǎn)角為10%，無規(guī)卷曲為13.3%，與前人所得結(jié)果基本一致，說明所得CHOM構(gòu)象未變。由此可知，所得CHOM符合后續(xù)過敏實(shí)驗(yàn)要求。

3、>　　 本研究成功地建立了豚鼠過敏癥模型。間接ELISA測(cè)得過敏豚鼠抗血清的最大效價(jià)為4，000。說明CHOM能有效的刺激豚鼠產(chǎn)生IgG抗體。
　　 研究了熱處理過程中CHOM空間構(gòu)象及過敏原性的變化。CD光譜研究數(shù)據(jù)顯示，未處理CHOM，其二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角及無規(guī)卷曲含量含量分別為27.8%、50.2%、10%、12%。經(jīng)100℃下處理120 min后，其含量分別為6.3%、20.5%、20%、53.2%

4、。與處理前相比，α-螺旋含量下降了77.3%，β-折疊含量下降了59.2%，而無規(guī)卷曲含量升高了77.4%。由此可知，隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長，其α-螺旋、β-折疊含量逐漸減少，β-轉(zhuǎn)角含量呈升高趨勢(shì)，而無規(guī)卷曲含量逐漸增加顯著。ANS熒光探針光譜結(jié)果為隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長，CHOM的表面疏水性呈降低趨勢(shì)。紫外光譜研究結(jié)果為所有樣品的最大吸收峰均在280 nm附近，并未發(fā)生明顯的藍(lán)移或紅移，但其最大吸光度有變化。

5、隨著加熱溫度的升高和加熱時(shí)間的延長，其最大紫外吸光值呈上升趨勢(shì)。間接競爭ELISA法測(cè)定熱處理CHOM過敏原性的變化結(jié)果顯示，70℃、80℃、90℃、100℃下，熱處理60 min后，可檢測(cè)到的CHOM分別為37.47μg/mL、20.52μg/mL、8.06μg/mL、6.24μg/mL，100℃下，熱處理120 min后，可檢測(cè)到的CHOM僅為3.22μg/mL。由此可知，隨著加熱時(shí)間的延長，加熱溫度的升高，能與sIgG結(jié)合的CHO

6、M的量越來越低，即其致敏性越來越低。由此表明，熱處理可以降低其致敏性。熱動(dòng)力學(xué)參數(shù)分別為D70為2.13×102、D80為1.49×102、D90為1.41×102、D100為1.15×102?？梢园l(fā)現(xiàn)，D值隨著溫度的升高而降低。且在70～90℃范圍內(nèi)，免疫活性的降低幅度要大于100℃時(shí)的。并且可根據(jù)D值計(jì)算求得Z值，為12℃。所以可得到結(jié)論，CHOM的免疫活性隨著溫度的升高，和時(shí)間的延長而逐漸降低。
　　 研究了MR反應(yīng)對(duì)CH

7、OM過敏原性的影響。制備了不同反應(yīng)條件下的MR反應(yīng)產(chǎn)物，并采用相對(duì)熒光強(qiáng)度和相對(duì)吸光度值來表征其MR反應(yīng)進(jìn)程，結(jié)果顯示，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長，MR反應(yīng)產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度和吸光度呈增大趨勢(shì)。反應(yīng)3d時(shí)，產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度和吸光度達(dá)到最大，但反應(yīng)4d時(shí)，不再發(fā)生顯著變化。所以選擇3d為最適反應(yīng)時(shí)間。當(dāng)反應(yīng)物起始pH值低于7時(shí)，產(chǎn)物的相對(duì)熒光強(qiáng)度和吸光度值很低。但pH達(dá)到7以后，增加幅度明顯加大。當(dāng)pH值為9時(shí)，達(dá)到最大值。當(dāng)pH值增至11時(shí)，

8、MR進(jìn)程又有所降低，所以綜合考慮，選取起始pH9作為最適反應(yīng)物起始pH值。當(dāng)果糖：CHOM為1:1時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度和吸光度值很低，說明MR程度很低。當(dāng)兩者為1:2時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度和吸光度值最大，即MR進(jìn)程最大，當(dāng)比例繼續(xù)增大時(shí)，其值呈下降趨勢(shì)，即MR進(jìn)程逐漸減慢了，所以選取1:2作為果糖：CHOM的最適質(zhì)量比。間接競爭ELISA法測(cè)定CHOM美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的過敏原性的變化結(jié)果為，MR反應(yīng)時(shí)間2d時(shí)，可檢測(cè)到的CHOM濃度為5μg/mL左

9、右，3d～4 d時(shí)，其濃度僅為1.5μg/mL左右。MR反應(yīng)起始pH<7時(shí)，可檢測(cè)到的CHOM濃度為10μg/mL左右，當(dāng)pH>7時(shí)，其濃度越來越低，當(dāng)pH為9時(shí)，僅為1.5μg/mL左右。當(dāng)反應(yīng)物中果糖與CHOM以1:1質(zhì)量比混合時(shí)，產(chǎn)物中可檢測(cè)到的CHOM濃度為10μg/mL左右，但當(dāng)反應(yīng)物中果糖與CHOM以1:2質(zhì)量比混合時(shí)，可以檢測(cè)到的CHOM濃度僅為1.5μg/mL左右。當(dāng)比例繼續(xù)增大時(shí)，可檢測(cè)到的CHOM濃度呈增大趨勢(shì)。

10、r>　　 通過SDS-PAGE和間接競爭ELISA相結(jié)合的方法研究了體外模擬胃腸道消化對(duì)CHOM過敏原性的影響。結(jié)果表明，經(jīng)胃腸液消化后，能與sIgG結(jié)合的CHOM的量變化甚微。消化2 min后，其濃度幾乎保持在45.5μg/mL左右。結(jié)合胃液消化產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果分析，2 min后，分子量為28 kDa左右的高分子量條帶仍幾乎未變，而低分子量帶變的越來越模糊。由此可以推測(cè)，經(jīng)胃液消化的CHOM的肽段仍具有致敏作用，而且很可能