花生過(guò)敏原蛋白Arah1的純化與表達(dá)研究.pdf

1、花生是世界八大類(lèi)過(guò)敏食物之一,并且由于花生過(guò)敏反應(yīng)具有長(zhǎng)期性、普遍性、嚴(yán)重性等特點(diǎn),已引起全球范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。現(xiàn)階段,人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了11種花生過(guò)敏原蛋白,其中Arah1蛋白含量最高,且被90％的花生過(guò)敏患者的血清所識(shí)別,是花生主要過(guò)敏原之一。因此,本文的主要研究工作圍繞Arah1展開(kāi)。
　　 論文主要工作包括從花生種子中分離純化天然過(guò)敏原Arah1、兔抗天然Arah1蛋白多克隆抗體的制備、Arah1基因的克隆、重組Arah1的

2、原核表達(dá)與純化。研究的主要方法與結(jié)論如下:
　　 1.先后采用DEAE-SepharoseFastFlow陰離子交換層析、Superdex200凝膠層析及ConASepharoes4B親和層析等三步分離純化花生過(guò)敏原Arah1,并利用MALDI-TOF/MS對(duì)所分離的蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明,本方法可分離純化得到純度為90%以上的天然Arah1,提取得率為43毫克/10克花生。
　　 2.以純化的天然Arah1為抗原,免疫

3、新西蘭大白兔,獲得兔抗Arah1多克隆抗體,通過(guò)ELISA和免疫印跡方法檢測(cè)其效價(jià)和特異性,結(jié)果表明,該抗體效價(jià)達(dá)1:200,000,且不與花生中其他蛋白發(fā)生交叉反應(yīng),能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。
　　 3.利用SVTotalRNAIsolationSystem試劑盒從花生種子中提取花生總RNA,采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得花生過(guò)敏原Arah1基因,并將其克隆入pMD18-TSimpleVector載體,再導(dǎo)入E.coliDH5α克

4、隆菌保存。對(duì)目的基因進(jìn)行的序列測(cè)定表明,該基因與已報(bào)道的Arah1序列具有99%的同源性。
　　 4.雙酶切重組質(zhì)粒pMD18-T-Arah1得到Arah1目的基因,連接至pET-32a表達(dá)載體中構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-32a-Arah1,并將其轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)plysS中,IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出重組蛋白Arah1,并通過(guò)SDS-PAGE與免疫印跡實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。然后對(duì)表達(dá)宿主菌進(jìn)行不同IPTG濃度、不同搖床轉(zhuǎn)速、不同誘