親水性聚合物在基因載體、表面蛋白固定及蛋白結(jié)晶方面的應(yīng)用.pdf

1、原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(ATRP)自1995年誕生以來,發(fā)展速度驚人,不僅成為當(dāng)前最重要的“活性”/可控聚合方法,而且已經(jīng)延伸到各種功能材料領(lǐng)域中。在生物材料領(lǐng)域也得到廣泛應(yīng)用,主要包括生物材料表面改性和生物大分子載體兩方面。多肽/蛋白類藥物和基因治療的前景誘人,但對(duì)其載體的要求很高,多才多藝的ATRP技術(shù)很有可能就是合成其載體的最佳方法。
　　 本論文應(yīng)用ATRP的聚合方法合成了一系列親水性聚合物,并從聚合物基因載體、固定蛋白質(zhì)的

2、硅片表面的改性以及溶菌酶蛋白結(jié)晶沉淀劑三方面討論了合成聚合物的結(jié)構(gòu)對(duì)于基因轉(zhuǎn)染效率、硅片表面的蛋白質(zhì)分子固定以及溶菌酶蛋白結(jié)晶的影響。
　　 隨著基因治療研究的不斷深入,選擇更安全有效的基因轉(zhuǎn)移載體己成為基因治療成功的關(guān)鍵。病毒載體基因轉(zhuǎn)移效率很高但其主要缺點(diǎn)是具有免疫原性,使用的安全性差；一些合成載體雖然比重組病毒載體更安全,但基因轉(zhuǎn)移效率不能達(dá)到要求。近幾年合成了一系列專門為基因轉(zhuǎn)移而設(shè)計(jì)的聚合物基因載體,并研究了它們結(jié)構(gòu)-

3、功能的相互關(guān)系。隨著對(duì)聚合物基因轉(zhuǎn)移機(jī)理的更深入的理解和對(duì)現(xiàn)有聚合物載體更進(jìn)一步的完善。聚合物基因轉(zhuǎn)移體系將成為人類基因治療的有力工具。
　　 論文首先研究了嵌段順序?qū)酆衔锘蜉d體的影響。選用生物相容性好的甲基丙烯酸聚乙二醇單甲醚酯(PEGMA)和帶有胺基的DMAEMA為單體,利用ATRP方法“活性”何控和所合成聚合物分子量分布較窄的特點(diǎn),合成了分子量相近且PDMAEMA嵌段含量相近,但嵌段結(jié)構(gòu)不同的雙嵌段共聚物PDMAEMA

4、-b-poly(PEGMA)和三嵌段共聚物PDMAEMA-b-poly(PEGMA)-b-PDMAEMA。以這兩種聚合物凝聚質(zhì)粒DNA分子,用瓊脂糖凝膠電泳、原子力顯微鏡(AFM)及動(dòng)力學(xué)光散射(DLS)等表征方法分析DNA分子凝聚的形態(tài)和大小,并進(jìn)行了293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明,盡管兩種嵌段共聚物所帶電荷相同,不同的嵌段結(jié)構(gòu)導(dǎo)致了所形成的陽(yáng)離子聚合物/DNA復(fù)合物,即使在相同N/P比的情況下,在溶液中的組裝結(jié)構(gòu)和所帶表

5、面電荷也有所不同,并導(dǎo)致了對(duì)293T細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效率和毒性有較大的差異。
　　 然后進(jìn)一步討論了聚合物的胺基密度對(duì)聚合物基因載體的影響。利用ATRP方法可以在單體上連接功能基團(tuán)的特點(diǎn),實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)合成了胺基密度不同的多胺類聚合物PBAMAM、PBAMAM-b-poly(PEGMA)和PBAMAM-b-PDMAEMA。以這三種聚合物凝聚質(zhì)粒DNA分子,用瓊脂糖凝膠電泳和原子力顯微鏡(AFM)進(jìn)行了觀測(cè)并進(jìn)行了293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

6、實(shí)驗(yàn)證明適當(dāng)?shù)陌坊芏葘?duì)聚合物基因載體的性能十分重要。
　　 蛋白質(zhì)微陣列分析中的一個(gè)研究熱點(diǎn)是基底表面固定蛋白質(zhì)分子的能力,所固定的蛋白質(zhì)分子既保持本身的構(gòu)象又保持原有的活性位點(diǎn)。利用共價(jià)連接或非共價(jià)親和結(jié)合,有一些技術(shù)已被用來固定蛋白質(zhì)分子和其他生物分子。多數(shù)情況下這些固定方法是非特異性的,所固定的蛋白質(zhì)分子在基底表面是隨機(jī)取向的。ATRP方法能在生物材料表面生長(zhǎng)一層致密的分子刷,從而改變生物材料原有的表面性質(zhì)。將分子刷末端

7、修飾上功能基團(tuán),可以實(shí)現(xiàn)基底表面對(duì)蛋白質(zhì)分子的共價(jià)偶合固定。共價(jià)偶合固定蛋白是制備蛋白質(zhì)微陣列的重要方法,也有較多優(yōu)點(diǎn):(1)與物理吸附相比,共價(jià)結(jié)合使蛋白質(zhì)分子與基底表面結(jié)合得更牢固,檢測(cè)信號(hào)更強(qiáng)；(2)共價(jià)偶合的方法可以有效的降低蛋白質(zhì)分子對(duì)基底的非特異性吸附;(3)分析物范圍較寬,可以是小分子也可以是生物大分子或細(xì)胞器等。
　　 實(shí)驗(yàn)中在硅片表面合成了poly(PEGMA)分子刷,并利用ATRP方法可以在聚合物末端連接功能

8、基團(tuán)的特點(diǎn),在分子刷末端用NHS基團(tuán)修飾,得到了Si-poly(PEGMA)-NHS表面。通過X射線光電子能譜(XPS)、AFM和掃描電子顯微鏡(SEM)等方法對(duì)硅片的每步修飾進(jìn)行了表征,并對(duì)實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)的三種表面:Si-poly(PEGMA)、Si-poly(PEGMA)-amine和Si-poly(PEGMA)-NHS固定蛋白質(zhì)分子的效果進(jìn)行了比較。前兩種表面分別是通過物理吸附和靜電作用固定蛋白分子的。我們發(fā)現(xiàn)通過共價(jià)鍵與蛋白分子連接

9、的Si-poly(PEGMA)-NHS表面對(duì)蛋白分子的固定效果最好。盡管這種修飾方法仍存在不足之處,但為共價(jià)固定蛋白分子提供了一種新的思路。
　　 蛋白質(zhì)等生物大分子是生物活性物質(zhì)中非常重要的一類,他們?cè)卺t(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)等領(lǐng)域具有很高的應(yīng)用價(jià)值,因此對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究就顯得尤為重要。而在目前來說只有通過獲得適當(dāng)?shù)牡鞍拙w、進(jìn)而通過X射線衍射才是確定蛋白質(zhì)空間三維結(jié)構(gòu)最可靠的辦法,因?yàn)橐跃w形式存在的蛋白質(zhì)是最穩(wěn)定的。蛋白質(zhì)分子的

10、結(jié)晶是一個(gè)多參數(shù)控制的復(fù)雜過程,包括物理、化學(xué)、生物化學(xué)等因素,具體的分為:溫度、時(shí)間、電解質(zhì)性質(zhì)、粘度、離子強(qiáng)度、過飽和度、蛋白質(zhì)純度、蛋白質(zhì)本身的對(duì)稱性以及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)等電點(diǎn)等因素的影響。為了獲得合適的蛋白晶體就必須對(duì)這些因素加以考慮,通過選擇合適的沉淀劑來提高蛋白的結(jié)晶效率。
　　 近年來,在生物礦化領(lǐng)域的研究中,嵌段共聚物通過自身在溶液中的自組裝來調(diào)控碳酸鈣等小分子物質(zhì)在溶液中的結(jié)晶形態(tài),進(jìn)而獲得高性能的復(fù)雜形貌

11、和多級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)合材料受到了廣泛的關(guān)注。這些形態(tài)的形成機(jī)制主要集中在聚合物的選擇性吸附、中尺度轉(zhuǎn)化以及高尺度組裝等方面。通過探討嵌段共聚物在溶液中的自組裝行為是否對(duì)蛋白質(zhì)分子的結(jié)晶有影響,可以進(jìn)一步拓寬蛋白質(zhì)結(jié)晶沉淀劑的選擇范圍。
　　 實(shí)驗(yàn)中合成了一系列聚合物,以這些聚合物作為溶菌酶蛋白結(jié)晶的沉淀劑。利用小角X射線散射(SAXS)、光散射(DLS&SLS)以及透射電鏡(TEM)等方法探討了嵌段共聚物在溶液中的自組裝行為,并觀察了

12、嵌段共聚物的結(jié)構(gòu)、濃度對(duì)溶菌酶晶體成核、晶體生長(zhǎng)以及晶體形態(tài)的影響。通過實(shí)驗(yàn)證明,含有PDMAEMA嵌段的聚合物有利于溶菌酶的結(jié)晶,聚合物的自組裝形態(tài)對(duì)蛋白分子的成核和晶體形態(tài)有很大影響。當(dāng)聚合物溶液中加入大量電解質(zhì)小分子(tascimate鹽溶液)時(shí),高離子強(qiáng)度使聚合物的自組裝遭到一定程度的破壞,最后形成的溶菌酶蛋白晶體形貌沒有明顯的差別。相反,從溶液中去掉這些小分子化合物后,在嵌段共聚物的作用下溶菌酶晶體的晶核數(shù)量、晶體大小及晶體形