環(huán)介導等溫擴增技術快速檢測肉制品產(chǎn)毒素性大腸桿菌的研究.pdf

1、病原微生物與食品污染構成了一個巨大并不斷擴大的世界性公共衛(wèi)生問題。產(chǎn)毒素性大腸桿菌導致的腹瀉是公共衛(wèi)生學上具有重要意義的人畜共患病之一。傳統(tǒng)方法操作繁瑣,檢測時間長,而且靈敏度較低;免疫學檢測方法特異性和靈敏度不理想;PCR方法敏感、快速,但由于需要昂貴的儀器設備、繁瑣的電泳過程,難以在基層普及和推廣。為確保食品安全與食品貿(mào)易,需要大力加強食品檢驗的力度,迫切需要建立快速、靈敏的產(chǎn)毒素性大腸桿菌的檢驗方法。
　　 環(huán)介導等溫擴增

2、技術(Loop-mediatedisothermalamplification,簡稱LAMP)是日本學者Notomi等于2000年發(fā)明的一種全新的核酸擴增方法。該技術利用能識別靶序列上6個位點的4個特殊的引物和一種具有鏈置換活性的DNA聚合酶,在恒溫條件下,特異、高效、快速地擴增核酸。
　　 本研究采用LAMP技術,針對產(chǎn)毒素性大腸桿菌耐熱腸毒素(heatstableenterotoxin,ST)基因保守序列為靶序列運用在線引物

3、設計軟件(https://primerexplorer.jp/lamp3.0.0/index.html)設計LAMP引物,同時驗證了引物的特異性及可行性。對BST酶添加量、dNTP濃度、反應時間、反應溫度、鎂離子濃度等擴增條件進行優(yōu)化,確定25μL的LAMP反應體系為:內(nèi)引物(FIP和BIP)各1.2μM,外引物(F3和B3)各0.3μM,0.5mMdNTP,4mMMgCl2,10×BstDNA聚合酶反應緩沖液,7.2U的BstDNA聚

4、合酶大片段,2μLDNA模板和用滅菌雙蒸水補足體系。LAMP反應過程是首先在62℃水浴鍋中反應30min,然后將其放入80℃水浴鍋中,水浴10min終止反應,通過肉眼觀察有無白色焦磷酸鎂沉淀,即可判斷是否發(fā)生了LAMP反應。此外,取擴增產(chǎn)物進行1％瓊脂糖凝膠電泳,觀察梯形條帶,以證實是否發(fā)生了LAMP反應。
　　 為了比較LAMP檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的靈敏度和人工污染檢出限,以PCR方法作對照。PCR引物是LAMP的兩條外引物(

5、F3和B3)。結果表明,LAMP檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的靈敏度為45.6CFU/mL,人工污染的生豬肉的檢出限為63CFU/g。采用試劑盒提取DNA,從樣品處理到報告結果,耗時1h。對照PCR耗時3h,檢測產(chǎn)毒素性大腸桿菌的靈敏度為4.56×102CFU/mL,人工污染產(chǎn)毒素性大腸桿菌的生豬肉的檢出限為6.3×102CFU/g。LAMP的靈敏度是PCR的10倍。
　　 研究表明:LAMP技術是一種檢測程序簡單、靈敏度和特異性較高的