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1、去氫表雄酮(dehydroepiandrosterone,DHEA)是一種C19腎上腺甾類化合物,主要具有抗癌、延緩衰老及免疫調(diào)節(jié)等作用。DHEA可由來源豐富價格低廉的薯蕷皂苷元為原料經(jīng)簡單的化學(xué)合成法而得到,而且由去氫表雄酮作為中間體能合成許多有重要生理活性的甾體類藥物,如7α-OH-DHEA的抗氧化活性及抗腫瘤作用均較顯著,1α-OH-DHEA是用于合成活性維生素D3及其類似物的一個重要的藥物中間體。
本文利用微生物轉(zhuǎn)化的
2、方法對去氫表雄酮進(jìn)行羥基化結(jié)構(gòu)修飾。通過平板透明圈初篩和TLC復(fù)篩,從實(shí)驗(yàn)室保藏的菌種中篩選到一株對去氫表雄酮(DHEA)轉(zhuǎn)化能力較強(qiáng)的菌株,經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察和16s rDNA分析鑒定,確定該菌為白色鏈霉菌。進(jìn)一步通過20L發(fā)酵罐擴(kuò)大培養(yǎng)富集轉(zhuǎn)化產(chǎn)物,經(jīng)硅膠柱層析、分子篩柱層析及高效液相制備柱等方法對轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行分離純化得到三種化合物,進(jìn)一步利用核磁波譜分析、質(zhì)譜及旋光性測定確定其化學(xué)結(jié)構(gòu),分別為7α-OH-DHEA,7β-OH-DHEA及
3、1α-OH-DHEA。
隨后對白色鏈霉菌轉(zhuǎn)化DHEA過程中發(fā)酵培養(yǎng)基和轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行了優(yōu)化,通過單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)確定了轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基中最優(yōu)碳源、氮源及無機(jī)鹽,分別為葡萄糖20g/L,酵母膏5g/L,硫酸銨8g/L,磷酸氫二鉀0.75g/L。最優(yōu)轉(zhuǎn)化條件如下:最適培養(yǎng)溫度為30℃,搖床轉(zhuǎn)速為160r/min,培養(yǎng)基初始pH為7.0,菌株斜面培養(yǎng)5d后制備孢子懸液,孢子懸液最佳接種量即發(fā)酵液終濃度為1×106個/mL,接種后48h添
4、加底物DHEA,底物添加方式為β-環(huán)糊精包埋,底物添加量為1mg/mL,轉(zhuǎn)化時間為加入底物后繼續(xù)轉(zhuǎn)化培養(yǎng)48h。綜合以上各優(yōu)化條件,單位菌體的總產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率達(dá)到37.96%,比條件優(yōu)化前提高了15.2%。
最后對白色鏈霉菌高效轉(zhuǎn)化DHEA的機(jī)理進(jìn)行了初步研究,利用CO還原差示光譜法測定細(xì)胞內(nèi)微粒體P450的含量,分析了菌體對甾體底物DHEA轉(zhuǎn)化過程中P450酶的變化情況,研究了P450酶的幾種誘導(dǎo)劑(苯甲酸、正己烷和鄰苯二甲酸異
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