功能化納米材料的生物效應與分子機制研究.pdf

1、納米材料已愈來愈多地應用于人類生活的方方面面,例如能源、環(huán)境、電子及生物醫(yī)學。納米材料的廣泛應用使其在人類與自然環(huán)境中迅速滲透,而人們對其生物效應卻知之甚少。隨著越來越多有關(guān)納米毒性的報道,人們對納米材料安全性的關(guān)注也逐漸被提上日程,其中的關(guān)鍵問題是了解納米材料的基本生物行為及其分子機制。本文立足于對幾種重要功能納米材料生物效應的研究,通過多種物理、化學與生物學手段發(fā)現(xiàn)了功能納米材料的蛋白質(zhì)結(jié)合、細胞攝取和對細胞信號傳導通路影響的若干規(guī)

2、律。這些規(guī)律的發(fā)現(xiàn)為納米材料的生物效應提供了理論解釋,闡明了納米材料生物行為的可能的機制和調(diào)控機理。這些發(fā)現(xiàn)同時也具有重要的應用價值:它為有效降低納米材料毒性、提高生物相容性提供方法學參考,并為納米材料作為治療試劑提供了可能性。
　　 本文首先研究了納米顆粒與蛋白質(zhì)的結(jié)合。納米顆粒趨于結(jié)合蛋白質(zhì)的性質(zhì)決定了它在人類和動物體內(nèi)的毒性以及自身被免疫系統(tǒng)調(diào)理和清除的命運。在該項工作中,通過改變多壁碳納米管(MWCNT)的直徑、表面化學

3、以及蛋白質(zhì)種類,借助穩(wěn)態(tài)熒光光譜、時間分辨熒光光譜和圓二色光譜等分析方法,研究了MWCNT與蛋白質(zhì)結(jié)合的機制。在對不同直徑(40 nm與10 nm)MWCNT的研究中發(fā)現(xiàn),直徑較大的具有更強的結(jié)合蛋白質(zhì)的能力。這個現(xiàn)象說明納米顆粒的表面曲率在其與蛋白質(zhì)結(jié)合過程中起到了關(guān)鍵作用。此外,碳納米管(CNT)的表面電荷和空間位阻也參與調(diào)節(jié)其與蛋白質(zhì)的結(jié)合,說明了CNT與蛋白質(zhì)雙方的電荷和立體化學性質(zhì)都對它們之間的結(jié)合產(chǎn)生了影響。另外,盡管蛋白質(zhì)

4、的自身熒光由于與CNT的結(jié)合而發(fā)生了淬滅,而其熒光壽命并沒有改變,說明這種熒光淬滅是由于形成復合物而發(fā)生的穩(wěn)態(tài)淬滅。通過圓二色譜法研究蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)時發(fā)現(xiàn),蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)受到了其與CNT結(jié)合的影響,因此可能會影響蛋白質(zhì)的生物功能。
　　 當CNT與細胞表面受體或細胞內(nèi)蛋白相互作用時,將會影響細胞的信號傳導通路。因此評估其細胞攝取和細胞內(nèi)定位對了解其生物效應的機制是必不可少的。目前已知CNT可以非常容易地穿過各種各樣的生物學屏障

5、而進入多種有機體,包括動物、植物及微生物,然而對其細胞攝取的機制和進入細胞后的轉(zhuǎn)運并不完全清楚。目前對CNT的細胞攝取、細胞內(nèi)定位和轉(zhuǎn)移機制尚存爭議。為了闡明細胞攝取的機制,我們利用透射電子顯微鏡對表面帶電荷的MWCNT的細胞攝取進行了超微結(jié)構(gòu)的觀察,發(fā)現(xiàn)了MWCNT的直接穿膜、內(nèi)吞、內(nèi)吞體泄露和細胞核定位等現(xiàn)象。我們結(jié)合文獻報道和自己的實驗觀察,推出了一個細胞攝取模型。在該模型中,將MWCNT分為兩組,一組是凝聚態(tài)的CNT團簇,另一組

6、是單個分散的CNT。團簇通過能量依賴性的內(nèi)吞過程進入細胞并首先進入內(nèi)吞體；內(nèi)吞體內(nèi)的團簇隨后變得疏松,使單根CNT釋放出來,釋放出來的單根CNT穿過內(nèi)吞體膜進入細胞質(zhì)；高度分散的單個CNT通過直接穿膜進入細胞質(zhì)；短CNT有可能進入細胞核；最后,所有種類的CNT都進入溶酶體并排出細胞。該模型將會對CNT的藥物傳遞和毒性研究產(chǎn)生重要影響。例如,基于此模型,細胞內(nèi)的CNT都有可能進入細胞質(zhì)并與其中的功能性分子發(fā)生未知的作用,從而造成某些細胞機

7、能的缺失。
　　 CNT進入細胞后,將不可避免地與細胞內(nèi)組分發(fā)生相互作用并產(chǎn)生時間和劑量依賴性的細胞反應。我們利用一個新型實時細胞電子傳感技術(shù)動態(tài)地監(jiān)控了CNT的細胞反應。這項技術(shù)利用整合在96孔細胞培養(yǎng)板底部的電子傳感器對貼附在其上的細胞進行電阻測量,并通過換算得出反應細胞多項指標的參數(shù)(細胞指數(shù)),細胞指數(shù)反應了細胞增殖、細胞形態(tài)、貼附及延展。這種技術(shù)無須生物標記、實時并且可以高通量的進行測試,克服了目前對于CNT細胞效應研

8、究中基于光度測量的諸多缺點,并使CNT細胞反應的動態(tài)監(jiān)控成為可能。利用該手段我們獲得了動態(tài)細胞反應曲線、時間依賴性IC50及細胞生長曲線的斜率等參數(shù)。這些參數(shù)是無法用傳統(tǒng)方法獲得的,為CNT及多種納米材料的生物效應研究提供了重要信息。
　　 由于CNT自身可以與蛋白發(fā)生相互作用、進入細胞并造成動態(tài)的細胞反應,因此,了解其細胞內(nèi)行為的分子機制是亟待解決的問題。這些問題包括哪些信號通路受到了影響、哪些基因的表達發(fā)生了改變及其后續(xù)的生

9、理效應是怎樣的。我們通過對羧基化單壁碳納米管(SWCNT-COOH)的動態(tài)細胞反應的監(jiān)控、全基因組表達分析和其他細胞生物學手段,發(fā)現(xiàn)它可以通過一種非凋亡的機制抑制細胞增殖。該機制與目前研究報道中未修飾碳管的效應是截然不同的?；赟WCNT-COOH對細胞增殖、基因和蛋白質(zhì)表達及蛋白質(zhì)磷酸化的影響,我們得出
　　 結(jié)論:該CNT抑制了Smad依賴性的骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號傳導通路并下調(diào)Id蛋白的表達。這些分子行為造成了細胞周期G1/S

10、過渡期的停滯和細胞增殖的抑制。SWCNT-COOH對該信號通路及基因表達的抑制表明了功能化CNT對人類細胞具有非凋亡效應。這個發(fā)現(xiàn)同樣對人類疾病的治療具有潛在的價值,例如與骨形態(tài)發(fā)生蛋白信號通路相關(guān)(骨科疾病)或與Id蛋白相關(guān)(乳腺癌)的疾病。
　　 盡管目前對納米顆粒/蛋白質(zhì)結(jié)合以及納米顆粒的細胞毒性研究都有分別報道,卻沒有關(guān)于納米顆粒/蛋白質(zhì)團簇形成與納米顆粒細胞攝取和動態(tài)細胞效應之間關(guān)系的研究。本課題研究并發(fā)現(xiàn)不同粒徑和表

11、面化學修飾的磁性納米顆?？梢越Y(jié)合不同種類和數(shù)量的蛋白質(zhì)而不影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)。羧基化磁性納米顆粒具有較高的細胞毒性,而PEG的修飾則降低了它們的細胞攝取和毒性。與較大粒徑材料相比,小粒徑磁性納米顆粒(羧基尤為嚴重)能夠結(jié)合更多的血清蛋白,進入細胞較少,但是卻造成更強的動態(tài)細胞反應。因而我們得出結(jié)論:對于水溶性磁性納米顆粒,除了其自身粒徑和表面電荷的影響外,納米/蛋白團簇的細胞效應還受吸附蛋白種類和數(shù)量的影響,并且與蛋白質(zhì)構(gòu)象變化無關(guān)。<

12、br>　　 納米技術(shù)的迅速發(fā)展,尤其是新型納米結(jié)構(gòu)的不斷涌現(xiàn),需要我們首先對其生物學效應進行評估。在論文的最后一部分,我們研究了一種新型功能化納米材料-核/殼-鐵/碳納米顆粒的細胞效應。該材料是最新開發(fā)的具有磁共振成像、磁熱治療和藥物傳遞應用前景的復合納米材料。但是目前對該材料與生物系統(tǒng)的相互作用并不清楚。為了闡明該材料潛在毒性及表面化學-生物相容性的關(guān)系,我們選擇幾種不同化學修飾的核/殼-鐵/碳納米顆粒,研究了它們的動態(tài)細胞反應、細